细胞凋亡实验
细胞凋亡的检测
原理
细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。
在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。而细胞坏死时,DNA随意断裂为长度不一的片段,琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”(smear ladders)条带。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时,也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合
于A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
再进一步用DNA Ladder 测定观察细胞凋亡情况。试剂
三尖杉酯碱(HT),300μg/ml, PI母液:500μg/ml,Ho33342母液:2mmol/L。溶解缓冲液 (含5OmM Tris、lOmM EDTA、O.5%肌氨酸钠、0.25mg/ml蛋白酶K)5Oml, 取lM Tris-HCl PH8.0 2.5m1、 5OOmM EDTA PH8.01ml、10%肌氨酸钠(先水浴溶解)2.5ml、lmg/ml蛋白酶K l2.5ml、 SDW31.5ml。TBE电泳缓冲液:(含90mM Tris、90mM 硼酸、2mM EDTA)l0O0ml,取1M Tris-HCl PH8.0 90ml、0.5M EDTA PH8.0 4m1、0.45M硼酸2OOml、SDW706m1。
仪器设备
荧光显微镜、载玻片、盖玻片、 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统。实验材料
人早幼粒白血病HL-60细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5%CO2条件下培养。
方法 1. 三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡
1)实验前约24小时,接种两瓶HL-60细胞,标记①、②,每瓶含约6ml培养液,置37℃,5%CO2培养箱培养。
2)实验前约2.5小时,当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200μl,使终浓度为1μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。
2.Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞
1)染色:将瓶中的细胞摇匀,取200μl于1.5ml的离心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15分钟。
2)滴片:取一载玻片,用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察,区别三种细胞,并注意三者比例。
注意
1).诱导培养HL-60细胞时间要准确。
2.)荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。
3. DNA Ladder 测定
1)收集2×106细胞(诱导凋亡细胞)离心沉淀,加0.5m1溶解缓冲液(视细胞量加减量)混匀,置50℃孵育1小时。
2)加RNaseA(O.l5mg/ml)于5O℃孵育1小时。
3)加10ul lOmM EDTA (含1%低熔点琼脂糖)
4)于70℃加热后,加入1.2%琼脂糖中,电压40V 电泳1.5小时(电泳缓冲液用TBE)。
5)电泳结束后于凝胶成像分析仪照相分析结果。