口蹄疫诊断技术规程

口蹄疫诊断技术规程

（NY／SY150-2000 )

1．范围

本规程规定了口蹄疫正向间接血凝试验、屠宰品中口蹄疫病毒检测试验及口蹄疫病毒RT - PCR检测试验。正向间接血凝试验适用于口蹄疫疫苗接种血清抗体水平监测、流行病学调查和进出口动物检疫；口蹄疫病毒检测试验和RT - PCR检测试验适用于猪的屠宰品中的口蹄疫病毒检测。

2．正向间接血凝试验

2.1试剂

2.1.1纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化蹂酸化绵羊红细胞，标准阳性、阴性血清，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。

2.1.2稀释液，配制方法见附录A。

2．2操作方法

2.2.1待检血清的灭活

将待检血清放人56℃水浴中灭活30分钟。

2.2.2待检血清的稀释

用稀释液将待检血清稀释成1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128， 1：256，1：512等8个稀释度。

2.2.3阴、阳性血清的稀释

用稀释液将阴性对照血清稀释成1:16，将阳性对照血清稀释成1：5120

2.2.4加样

在干净的V型96孔110°血凝板的第1～8孔加各稀释度待检血清50µ1，第10孔加1：16的阴性对照血清50µ1，第11孔加口蹄疫O型阳性对照血清（1:512) 50µ1；第12孔加稀释液50µ1（空白对照孔）。

第1～8孔和10～12孔加口蹄疫诊断液，每孔25µl。

如用液体诊断液，只需摇匀便可加样。若用冻干诊断液，则需提前7～10天加人稀释液（每瓶5m1 )浸泡（在4～6℃下），方可使用。

2.2.5振荡混匀

加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡1分钟，取下放在白纸上，观察血球应均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡。

2.2.6静置

振荡混匀后，取下血凝板并盖上大小适中的玻璃板，防止水分蒸发，室温下静置1.5～2小时，或次日判定结果。

2.3结果判定

2.3.1先观察对照孔，第10孔（阴性血清对照孔）、第12孔（稀释液对照孔）应无凝集现象，呈小圆点状（一）。

2.3.2第11孔（阳性血清对照孔）应有50％以上的血球产生凝集，即（＋＋）

（阳性反应）。

2.3.3在对照孔合格的情况下，观察的第1～8孔，以红血球呈“＋＋”凝集的待检血清的最大稀释度为其抗体效价。例如，第1排的第3孔出现“＋＋＋＋”凝集（90～100％红血球发生凝集），第4孔呈“＋＋＋”凝集（75％凝集），第5孔呈“＋十”凝集，第6孔呈“＋”凝集，则判定该份血清中的口蹄疫抗体效价为1：64（第5孔）。

2.4抗体效价与抗感染的关系：口蹄疫O型抗体1：128以上为免疫合格。

3．屠宰品中口蹄疫病毒检测

3.1材料准备

3.1.1器材：高速冷冻离心机、普通离心机、组织匀浆器、旋涡振荡器、V型(1350) 96孔微量反应板、微量振荡器、盐水接头、8号注射针头（磨成平口）、橡胶乳头。

3.1.2健康成年家免血清：62℃水浴30分钟灭能，冻结保存。

3.1.3口蹄疫A，O，C，Asia－I四型的红细胞诊断液及标准抗原，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，按说明书使用。

3.1.4被检材料的采取、输送和保存：在肉联厂、屠宰场等地采取材料，以采取淋巴结和脊髓为主。每种样品3～5克，装入小瓶置冰瓶中送往试验室。试验室收到材料后，立即向小瓶内装入被检材料4～5倍量的50％甘油、pH7. 6的0 . 05mo1/L磷酸一缓冲液（配制法见附录B）置－2 0℃保存，并详细记载材料名称、来源、采集时间、地点及保存条件。

3.1.5试验用乳鼠：每个样品应准备一窝10只2～3日龄吮乳小白鼠并带母鼠。

3.2操作方法

3.2.1被检材料的处理：

3.2.1.1取1克左右的淋巴结和脊髓等，分别用pH7. 6 ，0.05mol/L的磷酸缓冲液洗二次，用灭菌滤纸吸干，剥去被膜，称取0.5克。每20份样品随机混合为一份混合样品，加少许石英砂研细，加pH7.6, 0.05mol/L磷酸缓冲液89ml，制成1：10悬液，再加人10000单位／毫升的青霉素、链霉素1毫升，置4℃冰箱过夜。

3.2.1.2三氯三氟乙烷（F－113)处理：将3.2.1.1中制备的悬液，以8000r/min 4℃离心30分钟。取上清液置组织匀浆器的搅拌缸中，加人20% (V/V）低温预冷F- 113，以10000～12000r/min搅拌15分钟，将溶液移人离心管，8000r/min 4℃离心20分钟，吸取水相于三角瓶中，并量体积。

3.2.1.3聚乙二醇（PEG）浓缩：按3.2.1.2中制备的溶液容积加人10% (V/V）的PEG (M·W·6000）溶解，置4℃6小时或过夜。或加入等体积的饱和硫酸铰（饱和度50%pH7.6，配制方法见附录C) 4℃过夜。而后8000r/min4℃离心30分钟，去上清，沉淀用pH7. 6 , 0.05mol几的磷酸缓冲液悬浮至4ml，4℃过夜，再以8000r/min4℃离心30分钟，其上清即为25倍浓缩的病毒液。

3.2.1.4再次用F- 113处理：将3.2.1.3中的病毒浓缩液移人离心管，加入20％

(V/V) F一113，置旋涡振荡器振荡5分钟，再以8000r/niin 4℃离心30分钟，吸取水相，加1000单位嚎升的青霉素、链霉素1滴，用于接种乳鼠。

3.2.2乳鼠增毒：每份被检病毒浓缩液，接种2～3日龄乳鼠10只，每只皮下注射0.2ml，与母鼠同窝，于温暖的室内观察5天，随时收集发病或濒死鼠，置－20℃保存。

3.2.3反向被动血凝法鉴定毒型

3.2.3.1死亡鼠病毒悬液的制备：取死鼠胭体，用pH7.20.11mol/L磷酸缓冲液（配制方法见附录D)研磨成1:3悬液，4℃过夜，再4000r/min离心30分钟，取上清58℃水浴灭能40分钟，置4℃稍冷后再次离心，取上清作为鉴定毒型的病毒液。

3.2.3.2反向被动血凝：

a．死亡鼠病毒液稀释：用pH7.2, O.llmol/L磷酸缓冲液将病毒液稀释成8个滴度：1：6；1：12；1：24； 1：48； 1：96； 1：192；1：384；1：768。

b．反向被动血凝操作：每份检样占四排孔、每排的1～8孔加各稀释度的检样病毒液，用8号磨平针头，从第8孔开始加第8个滴度，每孔加2滴，直至加到第1孔的第一个滴度（1:6)。每排第9孔加稀释液2滴作为阴性对照，每排第10孔分别加A,O, C, Asia—I四型标准抗原各2滴，作为阳性对照。

将各型红细胞诊断液摇匀，于反应板的第一排至第四排分别滴加A, O, C, Asia—I型诊断液各1滴，置微型振荡器上振荡3～4分钟，再置室温1.5～2小时后判定。

3.3结果判定

3.3.1判定标准

＋＋＋＋：100％凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围。

＋＋＋：75 ％凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大小的小点。

＋＋：50％凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点。

＋：25％凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉淀于管底。．

—：红细胞完全沉积于管底成一圆点。

3.3.2结果判、．

3.3.2.1观察反应板上各排孔的凝集图形，四排孔中，任何一排的试验孔全凝集，而阴性对照不凝集，阳性对照凝集，其他三排试验孔不凝集，此时被检样品即为该排对应的毒型。

3.3.2.2使红细胞诊断液凝集达（＋十）以上者的抗原最高稀释度为其凝集价，任何一排孔的凝集价高于其他三排孔的凝集价2个对数（以2为底）滴度以上时，则判为与该排对应的毒型。

4.RT—PCR

4.1引物：VPIA, VPjB，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。按说明书使用。

4.2操作方法

4.2.1样品处理

4.2.1.1组织样品：在无菌室内将组织样品（淋巴结，脊髓，肌肉，水泡皮等）加灭菌石英砂磨碎，以灭菌PB (0.04mol/L, pH7.4)制成1:5悬液，室温放置2小时以上，或4～8℃冰箱过夜。3000r/min离心5分钟，取上清液作为检测样品。

4.2.1.2 O－P液样品：将O—P液倒人灭菌离心管中，然后加人至少1/3体积的TTE，用高速匀浆器（10000r/min )乳化1分钟，如不立即进行试验，样品液要存放在－70℃

4.2.2总RNA的萃取用容量为1. 5m1，预先经0.1%DEPC处理过的塑料管提取。

4.2.2.1取被检样品液300µl。

4.2.2.2加变性液300µl。充分混匀后冰水浴5分钟。

4.2.2.3加2M醋酸钠60µl，混匀。

4.2.2.4加酚－氯仿－异戊醇混合液800µl。充分混匀后冰水浴5分钟。

4.2.2.5 8000r/min离心10分钟，将上层水相转人另一洁净管中。加800µl预冷的异丙醇。混匀后置－80℃ 1小时，或－20℃4小时以上或过夜。

4.2.2.6 12000r/min离心10分钟。尽可能倒干液体留下沉淀物。

4.2.2.7加800µl75％乙醇，轻轻摇荡2～3次后再12000r/min离心8分钟。倾去液体，晾干后的沉淀物即可用于反转录。

4.2.3反转录（Reverse transcription，RT)

反应液总量20川。向RNA沉淀管中加人：

A．引物（5pmol. ) 5µl

B. DEPC一ddH2O 9µl 70℃水浴5～10分钟，然后再加

C. dNTP (2.5mmol．）1µl

D. AMV RTase（IOU乍1) 1µl

E. 5×RT缓冲液4µl

高速离心10秒，置42℃水浴中温育60～80分钟。

4.2.4 PCR扩增

4.2.4.1样品PCR的扩增

反应液总量50µl，反应开始，先将反转录产物转人PCR扩增专用的小塑料管中。

A. RT产物20µl

B．引物VPIA (12.5pmol ) 2µl

VPIB（12.5pmol）2µl

C. DEPC一ddH20 18.5µl

置沸水中10分钟。随后置冰水中骤冷，再加人：

D. dNTP (2.5mmo1）4µl

E. 10 X PCR缓冲液3m1

F. Taq DNA聚合酶（5U/µl) 0.5µl

G．矿物油50µl

离心10秒钟．将反应管插人扩增仪中，指令已设定的程序开始工作。扩增反应共30个循环，每个循环包括变性94℃ 1分钟，退火55℃ 1分钟，聚合72℃

1. 5分钟，最后一次聚合延长为10分钟。如用0.2ml薄壁管，反应时间可缩短1/3。

4.2.4.2对照质粒DNA的PCR扩增

a．质粒DNA (2µg/µl) 2µl

b．引物VPIA (12.5pmol ) 2µl

VP1B（12.5pmol) 2µl

c . DEPC-ddH20 31.5µl

沸水浴10分钟。然后再加：

d.dNTP (2.5mmol） 4µl

e.10 ×PCR缓冲液 5µl

f . MgC12 (25mmol．） 3µl

g. Taq酶(5U/µl) 0.5µl

h．矿物油50µl。扩增反应30个循环，程序同上。

4.2.5电泳检测扩增产物

4.2.5.1制备1 %琼脂糖/TBE（或TAE）缓冲液凝胶，胶含0.5µg/m1嗅乙锭。

4.2.5.2取6~8µl扩增产物与2~3µl点样缓冲液混合后加入一个加样孔。

4.2.5.3电压80 ～100V，或电流40～50mA，电泳40～50分钟。

4.3结果判定

电泳结束后，将凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察。如某一被检样品扩增产物的DNA带与对照质粒扩增产物的带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该被检样品判定为阳性。

附录A 稀释液的配制

1．配制PH7.6磷酸盐缓冲液（PBS)

磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20) 35.8g

磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H20) 1.56g

氯化钠（NaCI) 8.5g

叠氮钠（NaN3) 1.0g

双蒸水或去离子水加至l000ml，充分溶解后，用pH6. 4～8.0精密试纸测定pH值，达到7.6为合格，15磅高压灭菌20分钟，4℃储存。

2．配制稀释液

取pH7. 6的PBS 980ml加56℃水浴灭活的正常兔血清或冻干兔血清20ml，充分摇匀，4℃储存备用。

附录B 磷酸缓冲液（pH7.6, 0.05mol/L)的配制

甲液：Na2HP04·12H20 17.9g加无离子水至1000m1 。

乙液：NaH2PO4·2H20 7.8g加无离子水至1000m1。

取甲液870m1，乙液130m1,混匀。

磷酸缓冲甘油

pH7.6、0.05mol/l磷酸缓冲液与等体积的甘油（分析纯）混合，15磅10分钟高压灭菌。

附录C 饱和硫酸按的配制

称硫酸铰(A-R) 800g，溶于热至70～80℃的1000m1无离子水中，搅拌至溶，用三角漏斗和脱脂棉热滤，于室温放冷后转置4℃冰箱中至沉淀析出，用25氨水调pH至7.6。

附录D磷酸缓冲液（pH7.2, 0.llmol/L)的配制

甲液：Na2HP04·12H20 39.4g加无离子水至1000m1。

乙液：NaH2PO4·2H20 17.2g加无离子水至l000ml。

取甲液720ml，乙液280m1，混匀。