叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离与荧光观察
姓名： 学号： 实验时间：2014.11.18
1. 实验目的
（1）通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
（2）观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L 氯化钠或0.4 mol／L 蔗糖溶液) 中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min 的条件下离心2min ，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min 的条件下离心5min ，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光) 的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光) ，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光) ，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光) ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。 另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
3. 实验材料和用品
（1）材料：新鲜菠菜叶
（2）试剂：0.35 mol／L 氯化钠溶液、0.01％吖啶橙染料
（3）器材：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、500ml 烧杯、250ml 量筒、滴管、10ml 刻度离心管、纱布、无荧光载玻片和盖玻片
4. 实验步骤
（1）选取新鲜的嫩绿菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g 放于150ml 0.35 mol／L NaCl溶液中。
（2）将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3—5min ，转速5000 r／min 。
（3）将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml 烧杯中。
（4）取滤液4ml 在1000 r／min 下离心2 min。
（5）取上层清液在3000 r／min 下离心5min （沉淀为叶绿体和细胞核混合物) 。
（6）将沉淀用2-3ml 0.35mol／L NaCl溶液悬浮。
（7）取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。
（8）另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01％吖啶橙橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。
5. 实验结果
Pic1 pic2
Pic3
Pic1是普通光学显微镜下观察到的未染色叶绿体图片，pic2是在落射式荧光显微镜下观察到的未染色叶绿体图片，叶绿体有自发荧光，是红色，pic3是落射式荧光显微镜下观察到的染色过得叶绿体图片，核酸在荧光下发绿光，橙色的叶绿体是显微镜荧光和叶绿体自发荧光叠加的最终效果。
6. 讨论与结论
（1）取菠菜叶时要去梗。
（2）差速离心前要配平。
（3）在用盖玻盖染色的叶绿体叶时，溢出的液体要用滤纸吸干净。
（4）真正做荧光染色时用的载玻片与盖玻片是石英的，背影标准应该是无色，但是由于本实验用的载玻片与盖玻片不纯，有背景色。
（5）荧光观察时选视野对焦距要用普通光源，调好后再换激发光源。
（6）由于荧光染料会有不同程度的衰减，选好视野后，应该先拍照再观察。