绵羊角蛋白关联蛋白8_2基因克隆与表达分析_张立春

（）：中国畜牧兽医　２０１５，４２１２３１４０３１４５－

Ｃｈｉｎａ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅｙ　ｙ　

ｄｏｉ１０．１６４３１．ｃｎｋｉ．１６７１７２３６．２０１５．１２．００５－ｊ

绵羊角蛋白关联蛋白８．２基因克隆与表达分析

张立春１，曹　阳１，孙福亮２，尹　峰３，朴庆林１，王晓阳１，金海国１＊，张明新１＊

（吉林省农业科学院畜牧科学分院，公主岭１延边大学农学院，延吉１１．３６１００；２．３３００２；

）吉林农业大学动物科技学院，长春２３．５２０５９

（，）摘　要：本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白８．基因ｍＲ２ｋｅｒａｔｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｏｔｅｉｎＫＡＰ８．２ＮＡ并分析该基因－　ｐ在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆实时荧光定量ＰＫＡＰ８．２基因并进行两个品种间的比较分析，ＣＲ方法分析两个品种间ＫＡＰ８．２基因的表达谱差，，异。结果表明已成功克隆出绵羊ＫＡ该片段长５其中Ｏ编码６Ｐ８．２基因ｍＲＮＡ，７４ｂＲＦ区１９２ｂ３个氨基酸，ｐｐ））甘氨酸（和酪氨酸（含量依次为２属于典型的ＨＧＧｌＴｒ３．８％和２０．６％，Ｔ－ＫＡＰ家族。多态性分析显示新吉细ｙｙ毛羊与小尾寒羊ＫＡ多态位点多位于Ｃ其中小尾寒羊ＫＡＰ８．２基因间存在丰富的多态性，ＤＳ区两侧，Ｐ８．２基因３′ＵＴＲ区ｃ１９２＋１９－３９出现一个疑似ｆｒｕｌｅｔ７－－ｊ的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异，表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达，而新吉细毛羊则因，

在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊ＫＡＰ８．２基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异，提示该基因与毛表型性状相关。

关键词：新吉细毛羊；小尾寒羊；基因克隆ＫＡＰ８．２基因；

（）中图分类号：Ｑ７８６　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７１７２３６２０１５１２３１４００６－－－

ＣｌｏｎｉｎａｎｄＥｘｒｅｓｓｉｏｎＰａｔｔｅｒｎＡｎａｌｓｉｓｏｆＫＡＰ８．２ＧｅｎｅｉｎＳｈｅｅ　　　　　　　ｇｐｙｐ　

１１２３１

，Ｃ，ＺＨＡＮＧＬｉｃｈｕｎＡＯ　ＹａｎＵＮＦｕｌｉａｎＩＮＦｅｎＩＡＯ　Ｑｉｎｌｉｎ　－　－　－ｇ，Ｓｇ，Ｙｇ，Ｐｇ

１１＊１＊

，ＺＷＡＮＧＸｉａｏＪＩＮ　ＨａｉＨＡＮＧ　Ｍｉｎｘｉｎａｎｕｏ　－ｙ－ｇ－ｇｇ，

（，Ｃ１．ＢｒａｎｃｈｏＡｎｉｍａｌ　ＨｕｓｂａｎｄｒＪｉｌｉｎ　ＡｃａｄｅｍｏＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｇｏｎｚｈｕｌｉｎ３６１００ｈｉｎａ；　　ｆ　ｙ，ｙｆ　ｇｇｇ１　

，Ｃ２．ＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｌｅｅｏＹａｎｂｉａｎ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔＹａｎｉ１３３００２ｈｉｎａ；３．ＣｏｌｌｅｅｏＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ　＆　　　　　ｇｇｆ　ｙ，ｊｇｆ　

，ＣＴｅｃｈｎｏｌｏＪｉｎｌｉｎ　ＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｈａｎｃｈｕｎ２５２０５９ｈｉｎａ）　ｇｙ，ｇｙ，Ｃｇ

：）ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｏｂｅｃｔｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｗａｓｔｏｃｌｏｎｅｔｈｅＫｅｒａｔｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｏｔｅｉｎ８．２（ＫＡＰ８．２ｅｎｅ　　　　　　　　－　　ｊｙｐｇ　ａｔｔｅｒｎ．ＩｎｆｒｏｍＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅａｎｄＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅａｎｄｔｅｓｔｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｅｘｒｅｓｓｉｏｎ　－　　　　－ｗ　　　　　　ｐｊｐｐｐ　　

，，ｔｈｉｓｓｔｕｄｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡ　ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｆｉｒｓｔｌａｎｄＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｗａｓ　　　　　　　　　　ｙｙ，ｃｌｏｎｅｄｂＲＴ－ＰＣＲ．ＩｎｔｈｅｅｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｅｒｎｓｏｆＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｉｎＳｍａｌｌｔａｉｌ　　　　　　　　　　－ｙｐｐ　ＨａｎｓｈｅｅａｎｄＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂＱＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅｃｌｏｎｉｎｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ　　　－ｗ　　　　　　ｐｊｐｙｇ　　　　

，ｔｈｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｔｈｅｌｅｎｔｈｏｆＫＡＰ８．２ｍＲＮＡ　ｗａｓ５７４ｂｃｏｎｔａｉｎｉｎａ１９２ｂ　　　　　　　　　ｇｐ，ｇｐ　ＯＲＦｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄａｒｏｔｅｉｎｏｆ６３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＴｈｅｓｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｂｅｌｏｎｅｄｔｈｅｔｉｃａｌＨＧＴ　　　　　　　　　　　　－ｐｇｙｐ

ＫＡＰｆａｍｉｌｂｅｃａｕｓｅｔｈｅｒａｔｅｏｆａｎｄｔｒｏｓｉｎｅｗｅｒｅ２３．８％ａｎｄ２０．６％，ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｔｈｅｌｃｉｎｅ　　　　　　　　　　ｙｙｐｙｇｙ　ｏｌｍｏｒｈｉｓｍａｎａｌｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｏｍｅｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓｉｎＫＡＰ８．２ｇｅｎｅａｎｄａｌｍｏｓｔ　　　　　　　　　　　ｐｙｐｙｐｙｐＳＮＰｓｌｏｃａｔｅｄｏｎｂｏｔｈｓｉｄｅｓｏｆＣＤＳｒｅｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｉｏｎｗｈｉｃｈｌｏｃａｔｅｄｏｎｔｈｅ３′ＵＴＲｃ１９２＋１９－３９　　　　　　　　　　　　　　ｇｇｏｆＫＡＰ８．２ｆｒｏｍＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅｍｉｈｔｂｅｔｈｅｔａｒｅｔｏｆｆｒｕｌｅｔ７．Ｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｅｒｎ　　－　　　　　　　－－　　ｐｇｇｊｐｐ　

，ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｗａｓａｍｕｌｔｉｌｅｏｒａｎｓｅｘｒｅｓｓｉｏｎｅｎｅａｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｎｉｆｉａｎａｌｓｉｓ　　　　　　　　　　　　－ｐｇｐｇｇｙ

收稿日期：２０１５０５１５－－

）；）基金项目：国家８吉林省农业科技创新工程项目；国家科技部“十二五”科技支撑计划（６３计划（２０１３ＡＡ１０２５０６２０１１ＢＡＤ２８Ｂ０５１５－－，：＿作者简介：张立春（男，黑龙江嫩江人，博士，副研究员，研究方向：动物生物技术，１９７７Ｅ－ｍａｉｌｚｈａｎｌｉｃｈ６３．ｃｏｍ－）＠１ｇ：金海国，教授，Ｅ－ｍａｉｌｋｈｋ１９６２＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者：

：张明新，研究员，Ｅ－ｍａｉｌｚｍｘｉｎ６３．ｃｏｍ＠１

２期　１张立春等：绵羊角蛋白关联蛋白８．２基因克隆与表达分析

３１４１

ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｅｒｎｓｏｆＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｉｎＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎａｎｄＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌ　　　　　　　　－　　　　－ｗｐｐｊ

，ｓｈｅｅｓ．ＩｎＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｗａｓｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｓｌｅｅｎ，ｌｉｖｅｒａｎｄｓｋｉｎｂｕｔｉｎ　－　　　　－　　　　　ｐｐ，ｐｐ，ＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｗａｓｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｓｋｉｎａｎｄｈｅａｒｔ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｔｈｅｒｅ　－ｗ　　　－　　　　　ｊｐ，ｐｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎａｎｄｅｘｒｅｓｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｅｎｅｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓａｔｔｅｒｎｗｅｒｅ　　　　　　　　　　－　ｇｇｐｙｐｐｐ

ｓｈｅｅａｎｄＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｕｅｓｔｅｄｔｈｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｏｍｅ　　－ｗ　　　　　　　　　ｊｐ，ｇｇｐ　ｈｅｎｏｔｅｓｏｆｗｏｏｌ．　　ｐｙｐ

：；ｅｎｅＫｅｗｏｒｄｓＫＡＰ８．２ｇｅｎｅＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅｃｌｏｎｉｎ　－ｗ　－　　　ｇｊｐ；ｐ；ｇｙ　ｒｏｔｅｉｎ，ｋｅｒａｔｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　角蛋白关联蛋白（－　ｐ

作为毛纤维基质的重要组成部分，通过二硫ＫＡＰ）填充于角蛋白中间丝周键与角蛋白中间丝交联，

１］

。典型的ＫＡ围［甘氨酸和Ｐ蛋白富含半胱氨酸、

依据３种氨基酸含量差别，酪氨酸，ＫＡＰ蛋白家族

寒羊，其中新吉细毛羊为吉林省农业科学院畜牧科学分院新近选育的超细型新品系，小尾寒羊为市售纯种小尾寒羊。本试验所用样品主要包括肩胛后皮肤毛囊组织和其他实质组织器官。不同毛囊周期皮肤毛囊组织样品具体采集方法为：用打毛剪对试验剪切０．羊肩胛局部剪毛，７０％酒精消毒，５ｍｍ的皮肤浸入Ｒ其他实质组织器官样品主ＮＡｌａｔｅｒ液中；肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、脑、卵巢要包括心脏、

具体采集过程为：屠宰场标准流程屠宰试验羊，等，

分别采集一定大小各组织器官样品，浸入ＲＮＡｌａｔｅｒ保存液中，运送至实验室－８０℃保存。１．２　主要试剂

ＲＮＡｌａｔｅｒ购自ＱＩＡＧＥＮ公司；Ｔｒｉｚｏｌ购自

Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司；ＭＤ１８ＤＮａｓｅⅠ、Ａａｒｏｓｅ－Ｔ载体、ｇｐｇＧｅｌＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ及ＥｘＴａａＫａＲａ　　　　ｑ酶均购自Ｔ公司；定量ＰＣＲ试剂ＬｉｈｔＣｃｌｅｒ４８０ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ　　　ｇｙＭａｓｔｅｒ购自罗氏公司。

１．３　总ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ合成

新吉细毛羊与小尾寒羊皮肤毛囊组织与其他实质组织器官总Ｒ简要方法ＮＡ提取采用Ｔｒｉｚｏｌ法，为：将１５０ｍＮＡｌａｔｅｒ保存液中取出，ｇ组织块从Ｒ转入含有１ｍＬＴｒｉｚｏｌ液与磁珠的１．５ｍＬ螺口离　心管中，将上述离心管固定于组织匀浆器中，４ｍｓ震荡研磨，提取各组织总ＲＮＡ。提取的总ＲＮＡ用琼脂糖凝胶电泳鉴定ＲＤＥＰＣ水充分溶解，ＮＡ完整性，紫外分光光度计检测其纯度与浓度，－７０℃保存备用。ｃＤＮＡ合成前总ＲＮＡ用ＤＮａｓｅⅠ处理确保不存在ＤＮＡ污染，ｃＤＮＡ合成反应参照

反转录试剂盒进行，具体步骤按说明书ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔｐ进行。

１．４　引物设计与合成

目前ＧｅｎＢａｎｋ数据库中尚未登录绵羊ＫＡＰ８．２基因信息，考虑到ＫＡＰ基因家族为单外显子基因，本试验将山羊ＫＡＰ８．２基因与绵羊全基因组比对。以比对基因组序列为模板设计克隆引物，待基因设计定量Ｐ同时ｍＲＮＡ克隆测序完成后，ＣＲ引物，

，）ＫＡ可分为高硫（超高硫（ｈｉｈｓｕｌｈｕｒＨＳＰ、ｕｌｔｒａ　ｇｐ

，ｈｉｈｓｕｌｈｕｒＵＨＳ）ＫＡＰ和高甘氨酸／酪氨酸　ｇｐ

［］

（／，ｈｉｈｔｒｏｓｉｎｅＨＧＴ）ＫＡＰ３种２。其中ｌｃｉｎｅ　　ｇｇｙｙ

表达顺序稍ＨＧＴ－ＫＡＰ主要表达于皮质层细胞中，３］

。不同种类毛发中落后于角蛋白中间丝基因［

在人头发中ＨＧＨＧＴ－ＫＡＰ含量变化较大，Ｔ－ＫＡＰ

含量仅为３％，小鼠中含量为１而在鼹鼠针毛中８％，

［］ＨＧＴ－ＫＡＰ含量高达３０％～４０％４。不同品种绵

如英国林肯羊和羊中ＨＧＴ－ＫＡＰ含量变异亦较大，

美利奴羊之间，ＨＧＴ－ＫＡＰ含量在４％～１２％之

５］

。毡用毛中由于突变导致ＨＧ间［Ｔ－ＫＡＰ基因表

致使毡用毛甘氨酸／酪氨酸含量降低，提示达下调，

［］

ＨＧＴ－ＫＡＰ与羊毛品质密切相关６。绵羊ＨＧＴ－

美利奴羊中该区域ＫＡＰ基因家族位于１号染色体，

与羊毛纤维直径ＱＴ提示ＨＧＬ座位相邻，Ｔ－ＫＡＰ［］

基因家族与羊毛细度直接相关７。ＨＧＴ－ＫＡＰ家族主要包括ＫＡＰ６、ＫＡＰ７和ＫＡＰ８。进一步划分

）和ＨＧ为ＨＧＴⅠ型蛋白（ＫＡＰ６ＴⅡ型蛋白（ＫＡＰ７

［８］

）。人ＫＡ和ＫＡＰ８Ｐ８基因中仅含有一个功能性

但最近陆续发现在山羊及绵羊中还存ＫＡＰ８基因，

在ＫＡ证实了ＫＡＰ８．２基因，Ｐ８家族物种间的差

９］

。本研究团队在以往的研究中成功克隆出异［

鉴于此，本试验以小尾ＫＡＰ８．１基因ｍＲＮＡ序列，

通过对两个品种羊寒羊与新吉细毛羊为研究对象，

基因多态性分析及不同组织器ＫＡＰ８．２基因的克隆、

官的表达差异分析，以此探讨该基因对小尾寒羊与新吉细毛羊两个品种间羊毛性状极端表型差异的影响。

１　材料与方法

１．１　样品采集

试验动物为９～１０月龄雌性新吉细毛羊和小尾

３１４２

中　国　畜　牧　兽　医４２卷　

以绵羊β引物ａｃｔｉｎ基因为内参基因设计内参引物，－

序列信息见表１。引物由哈尔滨博仕生物有限公司

表１　引物序列信息及扩增产物

Ｔａｂｌｅ１　Ｔｈｅｓｅｕｅｎｃｅｓａｎｄｔｈｅｒｉｍｅｒｒｏｄｕｃｔｓ　　　　　　ｑｐｐ引物ＰｒｉｍｅｒｓｓＫＲＴＡＰ８．２ＣｓＫＲＴＡＰ８．２Ｑａｃｔｉｎ－　β

）引物序列（５′′→３Ｐｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｓ　ｑ

合成。

）片段长度（ｂｐＰｒｏｄｕｃｔｌｅｎｔｈ　ｇ

５７４　１４９　９８　

退火温度（℃）Ａｎｎｅａｌｉｎｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｇｐ　

６２６２６２

Ｆ：ＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣ　

Ｒ：ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＴＡＧＧＧＧＧＡＡＣＡＦ：ＴＧＡＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＴＧＡ　Ｒ：ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＴＡＧＧＧＧＧＡＡＣＡＦ：ＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡＧＧＣＧＧ　ＴＣＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＴＣＴＣＡＴＲ：

１．５　ＰＣＲ扩增与基因克隆

基因扩增以皮肤毛囊组织ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ／反应体系为：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２．５ｍｍｏｌＬ　　

／下游引物各Ｍｉｘ２．５μＬ，１０μｍｏｌＬ上、ｄＮＴＰ　　／１μＬ，０．５ＵＬＴａ２μＬ，ｃＤＮＡ模板１μＬ，　ｑ酶０．μ

ｄｄＨ２Ｏ补足体系。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性

；，，２ｍｉｎ９４℃变性３０ｓ６２℃退火３０ｓ７２℃延伸，３０ｓ３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ；１２℃保存。扩增

与ｐ产物经琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收，ＭＤ１８－Ｔ载体连接，经大肠杆菌ＤＨ阳性５α感受态细胞转化，克隆委托生物公司测序，测序结果进行生物信息学分析。

１．６　实时荧光定量ＰＣＲ检测

实时荧光定量ＰＣＲ采用ＬｉｈｔＣｃｌｅ４８０Ⅱ定　　ｇｙ量ＰＣＲ仪。反应体系２０μＬ：ｄｄＨ２Ｏ８．６μＬ，１０倍　

稀释后的ｃＤＮＡ模板１μＬ，ＬｉｈｔＣｃｌｅｒ４８０ＳＹＢＲ　　ｇｙ／下游引物各ＧｒｅｅｎⅠＭａｓｔｅｒ１０μＬ，１０μｍｏｌＬ上、　

；０．２μＬ。ＰＣＲ扩增程序为：９５℃１５ｍｉｎ９４℃，，１５ｓ６２℃３０ｓ４０个循环。扩增结束后进行产物

熔解曲线分析。每个品种检测两个个体，每个样品

ｔ

法进行数据重复进行３次。检测结果利用２－△△Ｃ１０］

。分析并绘制柱形图［

现为起始位点不同，终止位点相同。第１个ＯＲＦ区编码７第２个Ｏ２３１ｂ７个氨基酸；ＲＦ区１９２ｂｐ，ｐ，

编码６具体核苷酸及氨基酸序列见图３个氨基酸，２。将第１个ＯＲＦ与第２个ＯＲＦ编码蛋白差异序列进行比对分析，结果并未发现在哺乳动物中存在类似氨基酸区段，提示第１个ＯＲＦ编码蛋白在绵羊）。绵羊ＫＡ体内可能并非真实存在（图２Ｐ８基因家族ＫＡＰ８．１与ＫＡＰ８．２氨基酸比对发现两者间同但差异多位于蛋白两端，位于蛋源性仅为６８．２５％，）富集区则白中间部位的甘氨酸（ＧｌＴｒ－酪氨酸（ｙ）ｙ。蛋高度保守，表明２个蛋白具有相似功能（图３）白基本理化性质预测发现绵羊ＫＡＰ８．２理论等电

为典型的酸性蛋白。Ｇ点为５．８７，ｌｙ含量达到而Ｔ为该蛋白含量最高２３．８％，ｒ含量达２０．６％，ｙ

的两类氨基酸。区别于Ⅰ型ＨＧＴ－ＫＡＰ，Ⅱ型）与ＨＧＴ－ＫＡＰ蛋白中还含有较高的苯丙氨酸（Ｐｈｅ

），半胱氨酸（绵羊ＫＡＣｓＰ８．２基因中，Ｐｈｅ含量为ｙ而Ｃ９．５％，ｓ含量仅为３．２％，Ｃｓ含量远小于ｙｙ从蛋白组成上证明ＫＡＫＡＰ８．１，Ｐ８．２与ＫＡＰ８．１蛋白之间的差异

。

２　结果与分析

２．１　绵羊ＫＡＰ８．２基因克隆与序列分析

以新吉细毛羊与小尾寒羊皮肤毛囊组织ｃＤＮＡ为模板，ＲＴ－ＰＣＲ扩增电泳检测结果显示已成功扩。扩增产增出特异性条带，片段约为６图１）００ｂｐ（物回收克隆测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ数据库比对发现所克隆的基因为ＫＡＰ８．２基因。片段长度为

分析显示该片段包含２个完整Ｏ表５７４ｂＲＦ区，ｐ，

；新吉细毛羊；小尾寒羊Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ１，２，

；；Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ１，ＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅ２，　－ｗ　ｊｐ

ＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅ－　　ｐ图１　绵羊ＫＡＰ８．２基因ＲＴＰＣＲ扩增结果－Ｆｉ．１　ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｓｈｅｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｂＲＴＰＣＲ　　　　－ｇｐｙ　　

２期　１张立春等：绵羊角蛋白关联蛋白８．２

基因克隆与表达分析

３１４３

灰色区为第１个Ｏ方框标示为第２个ＯＲＦ；ＲＦ

；ＳｈａｄｏｗａｒｅａｗａｓｔｈｅｆｉｒｓｔＯＲＦＢｏｘｌａｂｅｌｅｄｗａｓｔｈｅｓｅｃｏｎｄＯＲＦ　　　　　　　　　　

图２　新吉细毛羊ＫＡＰ８．２基因核苷酸及氨基酸序列Ｆｉ．２　ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｉｎＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅ

　　　　　　　　　－ｗ　ｇｑｊｐ

图３　新吉细毛羊ＫＡＰ８．１与ＫＡＰ８．２基因氨基酸序列比对Ｆｉ．３　ＴｈｅａｌｉｎｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｕｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＫＡＰ８．１ａｎｄＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｓｉｎＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅ　　　　　　　　　　　－ｗ　ｇｇｑｊｐ

２．２　新吉细毛羊与小尾寒羊ＫＡＰ８．２基因多态性选取小尾寒羊与新吉细毛羊各５只，分别扩增结果发现两个品ＫＡＰ８．２并进行序列多态性分析，种ＫＡ仅ｃＰ８．２基因存在９个ＳＮＰｓ位点，１５０位点且未引起氨基酸序列的改变。其位于ｃＤＮＡ区内，，他８个突变位点位于ＵＴ表２）值得注意的Ｒ区（

不同个体ＫＡ是，Ｐ８．２基因不同位点存在多态性的更为重要的是大部分位点表现为品种特异性。同时，

、由表２可知，ｃ７２ｃ１９２＋１４、ｃ１９２＋１７、ｃ１９２＋２４和－

表２　小尾寒羊与新吉细毛羊ＫＡＰ８．２基因多态性

提示ｃ１９２＋９５位点表现为种内相同而种间不同，

ＫＡＰ８．２基因在两个品种间具有较大的遗传距离。由于ＫＡ本Ｐ８．２基因多态位点多位于３′ＵＴＲ区，试验对３′ＵＴＲ序列进行了ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶位预测，结果显示小尾寒羊ＫＡＰ８．２基因在ｃ１９２＋１９－３９，出现一个疑似ｆ图４）目前尚ｒｕｌｅｔ７－－ｊ的作用靶位（不清楚绵羊中是否存在类似于ｆｒｕｌｅｔ７－－ｊ的同源物，如果存在，新吉细毛羊中因ｃ使得１９２＋２４突变，作用核心区丧失，从而可能逃避调控。ｌｅｔ７－ｊ

ｏｌｍｏｒｈｉｓｍＴａｂｌｅ２　ＴｈｅｏｆＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｉｎＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅａｎｄＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅ　　　　　　－　　　　－ｗ　ｐｙｐｐｊｐ　

ｃ７２－

Ｘｉｎ２－Ｈａｎ１－Ｈａｎ２－

ＧＡＡ

ｃ３５－Ｇ　Ａ　Ｇ　

ｃ１５０Ｃ　Ｃ　Ｃ　

ｃ１９２＋１４

Ｔ　Ａ　Ａ　

ｃ１９２＋１７

Ｔ　Ｇ　Ｇ　

ｃ１９２＋２４

Ｃ　Ｔ　Ｔ　

ｃ１９２＋４１

Ｃ　Ｃ　Ｔ　

ｃ１９２＋９５

Ｇ　Ａ　Ａ　

ｃ１９２＋１５８

ＴＴ

Ｃ

图４　新吉细毛羊、小尾寒羊ＫＡＰ８．２基因ｍＲＮＡ及ｆｒｕｌｅｔ７ｍｉｃｏＲＮＡ序列比对－－ｊ　

，Ｆｉ．４　ＴｈｅｓｅｕｅｎｃｅａｌｉｎｍｅｎｔｏｆＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｍＲＮＡｉｎＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅａｎｄｆｒｕｌｅｔ７　　　　　　　　－ｗ　－　　　－－ｇｑｇｊｐｐｊ　

ｍｉｃｒｏＲＮＡ

２．３　ＫＡＰ８．２基因组织表达分析

为验证绵羊ＫＡ试Ｐ８．２基因的组织表达规律，

验采集小尾寒羊与新吉细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、卵巢、脑、肌肉及皮肤毛囊组织，通过

３１４４

中　国　畜　牧　兽　医４２卷　

实时荧光定量ＰＣＲ方法检测ＫＡＰ８．２在不同组织器官中的表达情况。结果显示，ＫＡＰ８．２基因同样具有广泛表达的特性。为比较不同组织中ＫＡＰ８．２分布规律，以肌肉组织表达量为基准，分析各组织器官的相对表达量。结果显示，ＫＡＰ８．２基因在两个品种绵羊中存在完全不同的表达模式，结果见图５。由图５可知，肝脏和ＫＡＰ８．２基因在小尾寒羊脾脏、

皮肤毛囊组织中高表达，依次约为肌肉组织的２７、９和５倍，其他组织除卵巢有２倍上调外基本与肌肉组织持平。新吉细毛羊ＫＡＰ８．２则主要在皮肤和

表达丰度约为肌肉组织的１心脏中高表达，５和４倍，与小尾寒羊类似，卵巢组织同样有２倍的上调，其他组织如肺脏、肾脏、卵巢和脑组织中两个品种ＫＡＰ８．２表达趋于一致

。

，，心脏；肝脏；脾脏；肺脏；肾脏；小肠；卵巢；脑；肌肉；皮肤ＨＥ，ＬＩＳＰ，ＬＵ，ＫＩＧＵＴ，ＯＶＵ，ＢＲＮ，ＭＵＳ，ＳＫＮ，

；，；；；，；；；；；ＨＥ，ＨｅａｒｔＬＩＬｉｖｅｒＳＰ，ＳｌｅｅｎＬＵ，ＬｕｎＫＩＫｉｄｎｅＧＵＴ，ＧｕｔＯＶＵ，ＯｖａｒＢＲＮ，ＢｒａｉｎＭＵＳ，Ｍｕｓｃｌｅｐｇｙｙ

ＳＫＮ，Ｓｋｉｎ

图５　小尾寒羊及新吉细毛羊不同组织器官ＫＡＰ８．２基因表达分布Ｆｉ．５　ＴｈｅＫＡＰ８．２ｇｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＳｍａｌｌｔａｉｌＨａｎｓｈｅｅａｎｄＸｉｎｉＦｉｎｅｏｏｌｓｈｅｅａｔｔｅｒｎ　　　　　　　　－　　　　－ｗ　ｇｐｐｊｐｐ　

码区，也未引起氨基酸的突变，证明两个品种

３　讨　论

小尾寒羊羊毛属于典型的劣质毛，毛内同时存在着绒毛和两型毛，主要用于羊毛毡等低端纺织

１１］，品［而以新吉细毛羊为代表的超细型细毛羊，毛

ＫＡＰ８．２基因功能的一致性。由于多态位点主要

提示两个品种间可能存在不同表现为品种间差异，

转录调控机制，小尾寒羊与新吉细毛羊不同组织表达差异检测结果是很好的佐证。由于多态位点主要位于３而３′ＵＴＲ区，′ＵＴＲ区作为ｍｉｃｒｏＲＮＡ重要两个品种ＫＡ的靶标区，Ｐ８．２基因是否通过３′ＵＴＲ突变改变ｍ通过ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶位，ｉＲＢａｓｅ网站检索发现新吉细毛羊ＫＡＰ８．２基因的确因Ｃ１９２＋２４位点Ｔ＞Ｃ的突变导致疑似ｆｒｕｌｅｔ７－－ｊ作用靶位的丢

［１３］

失。截至目前，只在鱼类中发现ｌ哺乳ｅｔ７－ｊ存在，

质均一，毛细度等相关指标明显优于小尾寒羊，是高

１２］

。两个品种羊毛极端档纺织面料的主要原材料［

表型差异主要由其遗传基础所决定。本试验通过对两个品种羊与羊毛性状密切相关的ＫＡＰ８．２基因揭示该基因在两个品种的克隆及一系列比较分析，

羊间的差异，阐释该基因在羊毛毛用性状形成中的作用。

至目前为止，仅在山羊与绵羊中发现ＫＡＰ８．２基因的存在，本试验分析发现尽管所克隆到的但其ＫＡＰ８．２基因在ｍＲＮＡ长度上存在较大差异，

编码蛋白长度却较为一致；尽管两个蛋白同源性只有６但位于蛋白中心Ｇ８．２５％，ｌｒ富集区高度－Ｔｙｙ

９］

。多态位点多保守，说明两个蛋白功能的相似性［集中于蛋白Ｎ端与Ｃ端，提示两者间存在着细微差别与功能上的互补性。小尾寒羊与新吉细毛羊ＫＡＰ８．２多态性分析结果表明两个品种间尽管存在

较高的多态性，但多态位点主要位于ｍＲＮＡ的非编

本试验以ｆ动物中并未发现ｌｅｔ７ｒｕｌｅｔ７－－－ｊ类似物，ｊ成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ序列和Ｓｔｅｍｌｏｏ－ｐ序列对绵羊基因组进行基因检索，发现绵羊基因组中存在多处与鉴于不同物种间ｌｆｒｕｌｅｔ７ｅｔ７－－－ｊ高度同源的位点，ｊ

［１４］

家族高度的保守性，绵羊中完全可能存在ｌｅｔ７－ｊ。

这也是不同品种ＫＡＰ８．２基因表达差异调控研究的主要方向。

但并非全部为皮肤毛囊特ＫＡＰ家族成员众多，

１５］

，本研究结果显示绵羊ＫＡ异性表达基因［Ｐ８．２基

因具有多组织广泛表达的特性外，不同组织间存在较大表达差异。ＫＡ肝脏、Ｐ８．２基因主要在心脏、

２期　１张立春等：绵羊角蛋白关联蛋白８．２基因克隆与表达分析

（）：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ＭｉｃｒｏｓｃＲｅｖ，１９９１，４１４７８３．　－

３１４５

脾脏和皮肤组织中高表达。而品种间比较发现，新吉细毛羊皮肤组织ＫＡＰ８．２表达量显著高于小尾寒羊，该研究结果与绒山羊ＫＡＰ８．２基因的表达相

１６］

。不同品种绵羊中ＫＡ近［Ｐ８．１基因表达检测显１７］

，示毛用型绵羊显著高于肉用型［与本试验结果相

［６］ｉＳ　Ｗ，ＯｕａｎＨＳ，ＲｏｅｒｓＧＥ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ　Ｌ　　　　　－ｙｇｇ　

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一致。作为毛纤维结构蛋白，ＫＡＰ８．１和ＫＡＰ８．２基因的表达规律与两个品种羊皮肤生理结构密切相关，具体表现为小尾寒羊毛囊多为初级毛囊，而新吉细毛羊毛囊多为次级毛囊，小尾寒羊皮肤毛囊密度显著低于新吉细毛羊，另外从毛结构角度来看，小尾新吉细毛羊则为无髓毛，而寒羊毛主要为有髓毛，

其主要表达于ＫＡＰ家族蛋白主要构成毛纤维皮质，

次级毛囊组织，因此新吉细毛羊皮肤ＫＡＰ８基因高表达是其生理特征所决定的。其他组织如肝脏和脾脏中小尾寒羊与新吉细毛羊间ＫＡＰ８．２基因的表该结果同样与绒山羊ＫＡ达差异也较大，Ｐ８．２基因表达相一致

［１６］

，但目前除明确ＫＡＰ８基因参与毛发

生长发育的功能外，尚不清楚其是否具有其他的生理功能。小尾寒羊与新吉细毛羊ＫＡＰ８．２基因存在较大的多态性差异，这种差异可能引起基因表达目前尚不能做出小尾寒羊与新吉细毛羊调控变化，

品种间ＫＡＰ８．２基因遗传和表达差异与其毛用性状的表型差异存在必然联系的结论，该方向将是今后开展绵羊ＫＡＰ８．２基因研究的重要切入点。参考文献：

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（责任编辑　晋大鹏）