碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药机制及其控制

·检验与临床2012年7月第50卷第20期

碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药机制及其控制

何世国

宁波市鄞州人民医院检验科，浙江宁波

315040

[摘要]目的探讨碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药机制及其控制方法。方法常规细菌鉴定，药敏试验筛选CRE菌株，琼脂稀释法测定抗菌药对CRE菌株的MlC，改良Hodge试验与PCR检测碳青霉烯酶。结果CRE菌株标本分离率以尿液、痰液较高；药敏试验84.44%菌株对亚胺培南、美罗培南及厄他培南同时耐药；琼脂稀释法分离CRE菌株大多数以对碳青霉烯类高度耐药；改良Hodge检测93.33%菌株为碳青霉烯酶产生株；改良Hodge试验检测碳青霉烯酶的灵敏度与特异度均明显高于PCR方法（P

Theresistancemechanismsofresistantenterobacteriaceaebacterialofcar-bapenemanditscontrol

HEShiguo

DepartmentofClinicalLaboratory,YinzhouPeople'sHospitalofNingboCity,Ningbo315040,China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheresistancemechanismsofresistantenterobacteriaceaebacterialofcarbapenemanditscontrolmethod.MethodsRoutinebacterialidentification,drugsusceptibilitytestfilterCREstrains,agardilutionan-timicrobialdrugsonCREstrainsMlC,modifiedHodgetestandPCRdetectionofcarbapenemases.ResultsCREstrainofspecimenseparationrateinurine,sputumhigher;susceptibilitytestshowedthat84.44%ofthestrainstoimipenem,meropenemandertapenemresistancealso;agardilutionmethodCREstrainsisolatedmostofthecarbonhighlyresistanttocarbapenemantibiotics;modifiedHodgetestdetected93.33%ofthestrainsascarbapenemase-producingstrains;modifiedHodgetestfordetectionofcarbapenemasesensitivityandspecificityweresignificantlyhigherthanthePCRmethod(P

碳青霉烯类抗生素主要包括亚胺培南、厄他培南、美罗培南等，具有抗菌谱广、杀菌活性强等特点，是临床抗革兰阴性菌最有效的药物[1]。然而随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得了对此类药物的耐药性，使该类药物临床应用受到严峻挑战。肠杆菌科细菌主要包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌及阴沟肠杆菌等，据统计约占所有革兰阴性菌的60%～70%，是引起医院和社区感染最常见的病原菌[2]。碳青霉烯类抗生素同样是临床抗肠杆菌科细菌尤其是多重耐药菌株所致感染的最有效的抗菌药物，但随着耐药肠杆菌科细菌（CRE）的出现并不断增多，疗效降低、感染爆发流行、病死率提高[3]。这些证状迫使我们深入研究碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药机制，并探讨其控制方法。我科通过分子生物学技术揭示CRE菌株机制，为采取有效的抗感染措施提供实验依据，现报道如下。

青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌，且剔除同一患者分离的重复菌株。所有菌株经API或ATB条（法国生物梅里埃公司）鉴定。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATcc25922，均为研究保存的菌种。

1.1.2主要仪器及试剂仪器：VITEK自动化细菌鉴定仪，PE96OOPCR仪（ABI公司，美国），TaKaRaPCRThermalCy-clerDice（TaKaRa日本），35℃卵箱，高速离心机。试剂：API和ATB细菌鉴定条（均为法国生物梅里埃公司产品），PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司产品）。培养基：Mueller-Hinton（M-H）琼脂和肉汤（均为OXOID公司产品）。

1.1.3常用药物包括阿米卡星、庆大霉素、氨节西林、氨节西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢唑啉、头孢

吠辛、头孢克罗、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、头孢哌酮-舒巴坦、环丙沙星等，均为中国药品生物制品检定所标准品。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株实验菌株来自我院2010年1月～2011年6月临床送检分离的4859株肠杆菌科中筛选出的45株对任一碳

1.2实验方法

1.2.1菌种鉴定用API或ATB条进行常规细菌鉴定。

1.2.2CRE菌株药敏试验筛选按CLSI标准测定肠杆菌科细

菌对临床常用抗菌药物的敏感性，凡对亚胺培南、美罗培南

类药物耐药的主要机制之一。与PCR方法检测结果相比，改良Hodge试验方法检测45株碳青霉烯酶的灵敏度与特异度分别为96.67%（29/30）、13.33%（2/15），见表3。

表3

改良Hodge试验阳性阴性合计合计数×100%

碳青霉烯酶检测结果

和厄他培南三种抗菌药物任一药物耐药者即为CRE菌株。

1.2.3最低抑菌浓度测定琼脂稀释法测定临床常用抗菌药

物对CRE菌株的最低抑菌浓度（MlC），严格按CLSI标准进行。

1.2.4检测碳青霉烯酶采用改良Hodge试验方法严格按CLSI标准进行，并与PCR检测法对比分析。1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.145株CRE菌株分离结果

45株CRE菌株分别来源于尿液、痰液、血液、脑脊液，由表1可见CRE菌株标本分离率以尿液、痰液较高，分别同血液、脑脊液相比均有统计学意义（P

表1

标本尿液痰液血液脑脊液

*

PCR法

阳性

阴性

合计

29130

13215

42345

注：灵敏度=二者阳性数/阳性合计数×100%，特异度=二者阴性数/阴性

3讨论

细菌产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯类药物耐药的主要机制之一[4]。2001年美国首先报道了第一株产

KPC-1型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，此后有关肠杆菌科细

45株CRE菌株分离结果

分离出CRE菌株数

分离率（%）

菌中碳青霉烯酶基因种类与亚型逐渐被世界各国学者所发现及报道，其相关研究亦成为热点[5]。由于碳青霉烯酶的基因容易被质粒所介导，且质粒又因携带其他多种耐药基因，导致碳青霉烯酶菌株对临床常用的抗菌药全部耐药，此类菌株一旦暴发流行将对患者生命构成极大威胁[6]。近年来，肠杆菌科细菌耐药性的问题极为普遍，且CRE菌株呈迅速上升趋势，具有从单一菌株扩散至其他不同种属的细菌，从单一流行区域已扩散至多区域流行的传播特点[7]。因此，对碳青霉烯类药物耐药模式已出现多样化。而我们必须尽早掌握其耐药性特征与耐药机制，尽快采取有效措施，以遏制其引起感染的暴发流行。

为了应对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药率的快速上升趋势，美国CLSL终于在2009年推荐改良Hodge试验用于肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测。但有报道称改良Hodge试验在检测产KPC型碳青霉烯酶菌株时会出现假阳性结果，但灵敏度与特异度仍高于传统方法。近年来，研究表明严重的基础疾病、氟哇诺酮类药物的应用、广谱头孢菌素的应用及曾接受碳青霉烯类药物的治疗成为感染对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌的独立危险因素[8]。

本研究结果显示，所有CRE菌株中主要以尿液标本与痰液标本中的分离株为主，药敏试验结果提示分离的CRE菌株绝大多数为对碳青霉烯类抗生素高度耐药株。而肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率呈快速上升趋势，成为医院环境中CRE菌株的优势菌种。改良Hodge试验操作相对简单，不同的CRE菌株所产生的改良Hodge试验阳性结果的强弱程度有差别，这可能与碳青霉烯酶或其他类型的β-内酞胺酶水解碳青霉烯类抗生素的程度高低有关。

综上所述，碳青霉烯类药物的耐药机制非常复杂，一株细菌中可能同时存在多种耐药机制，并且这些机制间又相互作用、相互影响，导致产生不同的耐药表型，而探讨这些耐药机制对控制感染及新药研制开发十分必要。

1.601.270.42

2

*▲

n[**************]

221562

2

0.23*▲

注：同尿液相比P﹤0.05，痰液：χ=2.63，P=0.158；血液：χ=6.04，P=

0.037；脑脊液：χ2=7.36，P=0.022。同痰液相比▲P﹤0.05，尿液：χ2=2.63，P=0.158；血液：χ=5.91，P=0.038；脑脊液：χ=7.05，P=0.31

2

2

2.245株CRE菌株的药敏试验结果

药敏试验结果显示，38株菌株均对亚胺培南、美罗培南

和厄他培南同时耐药，所占比率为84.44%。

2.3琼脂稀释法测定结果

45株对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌中包括34株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，其对亚胺培南、美罗培南、粘菌素较敏感，而对头孢西丁和头孢哌酮/舒巴坦的敏感率较低，提示分离的CRE菌株绝大多数为对碳青霉烯类抗

生素高度耐药株。

表2

抗菌药物亚胺培南美罗培南厄他培南阿米卡星环丙沙星粘菌素头孢西丁头孢哌酮/舒巴坦

琼脂稀释法测定结果敏感株

敏感率（%）

n[**************]4

MIC503433256--256--

MIC90256>256>256--256--

681573422

17.623.52.914.720.61005.95.9

2.4碳青霉烯酶检测结果

改良Hodge试验方法检测45株CRE菌株的碳青霉烯酶的结果显示42例菌株为碳青霉烯酶产生株，比率高达93.33%。提示细菌产生碳青霉烯酶是CRE菌株对碳青霉烯

[参考文献]

[1]王辉，郭萍，孙宏莉，等.碳青霉烯类耐药的不动杆菌分子流行病学及

（下转第73页）

重要构成成分外，还参与合成胆汁酸、维生素D3以及类固醇激素等[2]。而血脂与动脉粥样硬化相关也得到了众多实验研究的支持[3，4]。

同型半胱氨酸为含硫氨基酸，由半胱氨酸和蛋氨酸代谢产生。多产自细胞内，而细胞外液含量往往很少，加之血浆中同型半胱氨酸70%结合白蛋白的形式存在，游离者只占很少一部分。当机体内叶酸、维生素B6、B12缺乏时，其代谢即可发生障碍，血浆中游离同型半胱氨酸含量明显上升。其氧化产生的过氧化氢和自由基可以使泡沫细胞形成增加，长久以往，血管壁增厚，动脉狭窄；另外同型半胱氨酸还可对血小板聚集造成影响，成为一种血栓形成剂。关于Hcy（同型半胱氨酸）与动脉粥样硬化关系的研究已有很多，均证实二者之间关系密切，本研究亦与之相符。

目前，越来越多的证据显示，动脉硬化的整个过程伴随着炎症免疫性疾病的发生发展。在冠状动脉受损的早期，这种炎症应答可以起到保护作用，而随着病情的进展，则可能发展为过度炎症，进而对斑块形成产生促进作用。C-反应蛋白多位于粥样硬化的内膜，而正常动脉内膜沉积则较少，当

同型半胱氨酸（μmol/L）

表1组别对照组

各组患者血脂、同型半胱氨酸及C-反应蛋白比较（±s）

n38

2支病变59

血脂（mg/L）

C-反应蛋白（mg/L）

8.59±2.3714.52±8.29*21.05±11.74*#

159.8

164.21±85.09238.50±110.87*

2.50±1.249.57±10.37*

观察组1支病变73

349.04±251.96*#13.62±12.11*#

135.2

61.9

3支病变4828.98±18.36*#@439.79±288.64*#@16.58±15.67*#@

F值

注：与对照组相比，*P＜0.05；与观察组1支病变者相比，#P＜0.05；与观察组2支病变者相比，@P＜0.05

t=4.3，与3支病变组的t=6.8，1支病变组的血脂与2支病变组的t=3.8，与3支病变组的t=5.9，2支病变组与3支病变组的t=2.8；对照组的同型半胱氨酸与1支病变组的t=3.6，与2支病变组的t=4.5，与3支病变组的t=5.7，1支病变组的同型半胱氨酸与2支病变组的t=3.4，与3支病变组

的t=5.4，2支病变组与3支病变组的t=1.7（P＞0.05）；对照组的C反应蛋白与1支病变组的t=4.1，与2支病变组的

t=5.6，与3支病变组的t=5.5，1支病变组的C-反应蛋白与2支病变组的t=2.1，与3支病变组的t=3.0，2支病变组与3支病变组的t=1.1（P＞0.05）。

由表1可以看出，动脉粥样硬化患者血清血脂、同型半胱氨酸以及C-反应蛋白较对照组明显升高，且随着病变分

支增多及动脉粥样硬化程度加重而升高明显。各组间差异明显（P＜0.05），有可比性。

C-反应蛋白与低密度脂蛋白结合后，可对血管内膜造成攻击损伤；另一方面，C-反应蛋白与单核细胞结合有促凝血作用；此外，C-反应蛋白本身还可以促使血管内皮细胞增生、血管

内膜增厚，这一切都导致血管阻力增加；加之炎症反应存在时超氧阴离子增多，大量消耗NO，使其输血管功能钝化。

总之，无论是血脂、同型半胱氨酸还是C-反应蛋白，在对动脉粥样硬化进行诊断、评估时都是独立的指标，如能将三者结合，同时进行检测，意义更大。

3讨论

随着老龄化社会的到来，动脉粥样硬化发病率越来越高，与其相关的一系列心脑血管疾病正严重威胁着人类的健康。

目前动脉粥样硬化发病机制中脂质浸润学说已经被大家所接受，当过量的脂质在动脉内膜及其下沉积，炎症细胞浸润、平滑肌细胞增殖，纤维脂质斑块形成，动脉壁增厚，血管变硬，更有甚者局部形成血栓，血管腔狭窄甚至堵塞。刘翠平等人也认为血脂蛋白可以通过参与形成泡沫细胞以及对纤溶和平滑肌细胞增殖产生影响而导致动脉粥样硬化发生[1]。血脂包括TG（甘油三酯）、TC（总胆固醇）以及游离脂肪酸。这些脂类成分在体内有众多重要的生理功能，除了是细胞膜的

[参考文献]

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（收稿日期：2012-04-20）

（上接第71页）

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（收稿日期：2011-12-01）

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