细胞计数方法
细胞计数
实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作:
一、准备工作:
取一瓶传代的细胞,待长成单层后以备使用。
二、细胞悬液制备:
细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS 液洗涤后,加入培养液(或Hanks 液或PBS 等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。
三、细胞计数:
1. 盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2. 制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3. 将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
4. 统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大格(每个大格含有16个中格)中没有被染液染上色的细胞数目。
5. 计算原细胞悬液的细胞数L :按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×2×10
说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1:1稀释。
公式中乘以10因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm (长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3。
四、细胞计数要点:
1. 进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于10个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;
2. 要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
3. 取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
5. 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。 444
五、初学者易犯的错误:
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六、本实验特殊试剂的配制:
4%台盼蓝母液:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
使用液:使用时,用PBS 稀释母液至0.4%即可。
= = = = = = = = = = = = = = = = = = 另一例 = = = = = = = = = = = = = = = = = 步骤:
(1)取50μl 细胞悬浮液与50μl trypan blue(or Erythrosinbluish)等体积混合均匀于
1.5ml 小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue
4等体积混合) ,最后乘以10,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上
线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞) 。
注:4大格细胞总数×稀释倍数×10/4=细胞数/ml;每一大格的体积
-4=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10ml
计数板计数时,最适浓度为5~10×10细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
T75 monolayer culture制成10ml 细胞悬浮液,取0.1ml 溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243 平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;
细胞数/ml:60.75×10×2(稀释倍数)=1.22×10;
细胞数/flask(10ml ):1.22×10×10ml=12.2×10
存活率:225/243﹦92.6%
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 最后再随便说说 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
原理都是一样的,我大部分也是借鉴集体智慧的结晶
我个人在做的时候感觉最重要的就是悬液一定要摇均匀,否则对后续的计数影响很大 而实际上做起来也是挺简单的,多做几遍,主要的几点记住了就OK (笑)
最后,也是最重要的一点 664654
一定要调好焦距,我们要计数的只是细胞,千万别计数其他的杂质(我最初很乌龙,汗;还好知道的人不多 = =+)