狄尔斯阿尔德反应和点击化学组合的双色聚糖标记活细胞
狄尔斯阿尔德反应和点击化学组合的双色聚糖标记活细胞 蛋白质糖基化是一种复杂的形式,他是翻译后的修改并且对于很多蛋白质显示了重要的功能。唾液酸被显著的放置在糖蛋白膜外的结尾处。它对于大量的细胞功能有着重要的作用并形成了一种细胞的保护膜。此外，它不断与环境的细胞作用,并有助于组织相容性。使得唾液酸化作用成为了人们感兴趣的领域,但是监测人体内的唾液酸是一种挑战.当蛋白质通常用基因的方法标记,比如表现为GFP融合蛋白,类似的方法并不能得到第二次基因产物,比如唐聚合物的多聚.低聚糖新陈代谢工程是一种成功的战略来显示多聚糖在试管外和试管内的位置.用这种方法,细胞被培养在非天然单聚糖衍生物中,携带一个信息集团,被细胞生物机械所接受.例如, Ac4ManNAz被细胞接纳,通过细胞酯酶脱去乙酰基.由于唾液酸生物合成酶的混乱,使他转变为了N-叠氮乙酰基甘露糖安丙酮酸并被唾液多糖共轭物所吸纳融合.一旦呈现在细胞表面, azide-containing sialylated glycan将会通过生物正交连接反应被看到.另外, Ac4ManNAz的单糖衍生物,N-乙酰半乳糖胺,N-乙酰氨基葡萄糖,和L-海藻糖适合于MOE,为细胞结构规则和多糖在细胞中的功能提供了更深刻的见解.
当前,主要是施丁陶格配体和叠氮-炔[3+2]环加成(Cu催化或者增大张力，也就是常说的click反应)被应用于MOE配体研究.然而，他们都依赖于叠氮的反应，因此不能用于两种不同的被包含的代谢的糖类的同时监测。一种标记策略在叠氮和炔烃存在的条件下被实施，显著的扩大了化学标记反应在活细胞中的范围，并得到了比较满意的结
果。
近期，资料表明，翻转电子的D-A反应，1,2,4,5-四嗪和有张力的亲二双烯体，比如，反式环辛烯，环丁烯，降冰片烯，环辛炔，取代的环丙烯实现了生物正交配体反应的要求，以及叠氮和炔正交环加成反应。然而，环炔烃或者动力学四嗪被期望通过唾液酸生物合成途径从类似的N-酰基甘露糖胺衍生物很有效的实现新陈代谢。为了研究更小的实现MOE的亲二双烯体，我们把末端单取代炔作为新的化学报道的类型。我们最近报道了末端炔烃和1,2,4,5-四嗪D-A反应在碳水化合物微数列准备的成功应用。事实上，末端炔烃很难在生物体中被发现，在蛋白质的完全缺席使他成为了有前途的信息基团。于此,我们所显示的ManNAc的衍生物所包含的末端炔烃在酰基侧链中是代谢的被并入细胞表面的唾液酸中,随后被D-A反应标记（图1）。而且，我们展示了两种不同修改的双重标记，被代谢并入的单糖可能会被D-A反应和大张力的叠氮-炔环加成反应结合。
末端烯烃和四嗪的耦合已经显示出了较高的产率,我们研究了这种配体反应的动力学.研究表明 DARinv反应在水中比在有机溶剂中反映的快得多.因此,我们附上了tri(ethylene glycol)连接体来获得水溶性的四嗪11.使用11和ManNPtl (1) and ManNHxl 反应定量的测量了动力学, pentenoyl的二阶反应常数为0.021 Lmol_1 s_1,己烯酰基化合物的二阶反应常数是0.041 Lmol-1 s-1.尽管遇有张力
图1. MOE作为化学信息集团用于末端炔烃的战略
直链烯烃和四嗪的反应速率对于位阻现象是非常敏感的，双键和更多取代基的很慢。另一方面，末端炔烃可以在没有激活物的情况下快速反应。这引起了我们从甘露糖铵盐中用三步设计甘露糖胺2和4的合成。在Keppler et al.的工作基础上，我们期望两种衍生物都被接受通过细胞用N-pentenoylmannosamine（2）（由于它较短的酰基侧链）以更高的效率被并入。另一方面，甘露糖胺衍生物4姬郗酰基侧链被期望在D-ARinv反应中更快，由于它的双键和缺电子酰基距离很远。
作为炔属系的另一个反应物，我们选择了一个双芳基四嗪，因为这些混合物先前显示出了足够的稳定性而不会水解，而这是生物正交化学的重要的先决条件。在模型反应中，pentenamide 7与四嗪8在DMSO中反应，得到dihydropyridazines 9a/b，9以两种互变异构体的形式存在，他们有等量的产率（计划1和支持信息）。液相色谱-质谱仪联用分析显示产物很容易被氧化为哒嗪类10a/b。为了完成这种转变，我们让9a/b与异戊基亚硝酸盐反应得到哒嗪类10a/b,通过柱层析净化后产率为78%。
已经显示出末端烯烃和一个的四嗪之间的耦合反应的优良率，我们研究了连接反应的动力学。已知的，该DARinv反应在水中比在有机溶剂快得多。因此，我们安装了三（乙二醇）链接器获得水溶性四嗪11（图3）。使用11和ManNPtl (1) and ManNHxl反应，可以进行定量动力学测量. 戊烯的二阶速率常数被确定为0.021Lmol-1s-1, 己烯化合物为0.041 Lmol-1s-1。虽然这些数字表明，与有张力的环烯烃相比，反应率较低的，它们与施丁陶格配体 (k=0.002 Lmol_1 s_1 in CD3CN/MeOH 95:5)[18] and SPAAC of a dibenzocyclooctyne (k= 0.0565 Lmol_1 s_1 in MeOH),相比，证明了对于生物正交标记反应有很好的应用价值。
为了测试新ManNAc衍生物对于MOE反应的稳定性 ，分别在
Ac4ManNPtl （2）和Ac4ManNHxl （4 ）存在下培养不同的细胞系。随后，细胞被共轭的四嗪生物素12标记，这种生物素在链霉亲和素标记的AlexaFluor – 647中培养 。图4a显示结果在Ac4ManNPtl （2）
中生长的HEK293T细胞 。共焦荧光显微镜清楚显示被标记的细胞膜，如预期的显着唾液酸化的细胞系。在对照实验是在没有2但其他条件相同的条件下培养细胞，但细胞基本上没有被着色。这是一个重要的结果，确认根据这些条件，该四嗪生物素结合物12不能和其他的细胞组件反应，如不饱和的细胞膜脂。图4b得到HEK293T细胞和Ac4ManNHxl的相应的结果。有趣的是，这两种糖2和4可以使细胞膜有相同强度的着色。在HeLaS3细胞中可得到相同的结果（见支持信息，图S15和S16 ） 。
目前为止，所有的甘露糖胺衍生物在MOE反应中被组装到了连有2-氨基的酰基链上。为了研究生物装置是否也能接受其他的官能团，我们使用了戊烯基氨基甲酸脂6，氨基甲酸酯有利于促进合成功能化的mannosamines胺，来源于醇类，比如说戊烯醇。MOE实验HeLa S3 细胞中Ac4ManNPeoc(6)和糖2，4有相同强度的着色。（图4c）。ManNPeoc (5)和四嗪11的D-A反应常数被测定为0.017 Lmol-1 s-1. 下一步，我们注意到使用D-A反应结合SPAAC同时侦测两种不同代谢的被并入的糖。HeLa S3细胞在烯烃标记的Ac4ManNPtl (2)和N-叠氮乙酰半乳糖胺(Ac4GalNAz, 14; Figure 5)中生长。然而，N-酰基甘露醇胺衍生物以生物合成的方式被转变为了唾液酸，作为端基糖蛋白被发现。研究表明，Ac4GalNAz (14)已经被并入了粘蛋白类型的O-聚糖。在对照试验中，仅有一种糖，或者没有糖被加入培养基。三天后，细胞通过D-A反应（随后和共轭的四嗪亲和素12一起在AF-647抗生蛋白链菌素中培养）和SPAAC（和AlexaFluor 488-双苯并环辛炔，
AF488-DIBO）被着色，被通过共聚焦荧光显微镜分析。
当两种糖被呈现在培养基中，我们发现了在两种频道中明显被标记的细胞膜（图6b）。whereas omission of one of the sugarsresulted in the absence of membrane labeling in the corresponding channel (Figure 6c,d). 有趣的是，叠氮频道显示了一些细胞内的着色，我们归功于非特异性着色，因为在控制实验中没有添加Ac4GalNAz时，他也是可见的 (14; Figure 6a,d)。环辛炔的非特异性着色最近被报道，也许这些结果来自于添加了SH基团的三键或者来自于非特异性结合的染料。另一方面，在D-A反应频道中几乎没有任何背景被发现着色（图6a,c）这些研究表明了在相同实验中，烯烃和叠氮作为化学信息基团的应用允许发现两种不同的代谢并入糖。
总之，我们已经证明，端基烯烃在N- 酰基甘露糖胺适用于化学信息基团作为代谢性低聚糖工程。由于它们比较小，与叠氮信息基团相比，较容易确认。他们被酶接受参与唾液酸合成，并入细胞表面糖复合物。我们可以进一步表明，这种途径是也可渗透为甘露糖的衍生物含有氨基甲酸酯功能。终端烯烃可以用一个生物正交的方式标记，使用的Diels-Alder反应逆电子需求，不需要有毒金属催化。此外，我们已经表明， DARinv可以在叠氮化物的存在下进行，它允许同时检测两种不同的糖。这种检测战略对于高级复聚糖的分析是很重要的。由于终端烯烃也很容易纳入其他生物分子，例如通过遗传密码扩张进入蛋白质，我们的标记方法不仅可以确认碳水化合物代谢工程，而且有广泛的适用性。