实验指导书(氨基酸工艺学)
氨基酸工艺学
实 验 指 导 书
2013年8
月
实验规则························································································································ 1 总论································································································································ 2 实验基本技能················································································································ 4 谷氨酸发酵系列实验·································································································· 12
1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者,须在教师指定的时
间内预习完毕,方得参加实验。
2、实验前须认真检查仪器、试剂、用具及实验材料。如有破损、短缺应立即报
告指导教师,经同意后方可调换和补充。对玻璃器皿须做好清洗工作。
3、实验过程中不得随便挪动外组的仪器、用具和实验材料。不得随意拨动仪器
开关或电源开关,须按实验要求进行。
4、实验材料、药品的使用,应在不影响实验结果的前提下注意节约,杜绝浪费。
5、实验室应保持肃静,不得谈笑喧哗,不许搞其他动作,以免影响他人实验。
6、清洗仪器、用具、材料时,须将固形物倒入指定容器内,不得直接倒入水槽,
以免造成水管堵塞。
7、实验过程中,须按操作规程仔细操作,注意观察试验结果,应及时记录。不
得抄写他人的实验实习记录,否则,须重做。如有疑问,应向指导教师询问清楚后方可进行。
8、实验完毕后,须将玻璃仪器、用具等清洗干净,按原来的位置摆设放置。如
有破损须报告指导教师,并填写仪器损坏登记簿。
9、在进行实验过程中,不得随意食用原料和加工品。
10、实验结束后,由值日生负责打扫实验室,保持室内整洁,注意关上水、电、
窗、门。
总论
一、实验要求
1.实验前必须预习实验指导和有关理论,明确实验目的、原理、预期的结果,操作关键步骤及注意事项。
2.实验时要严肃认真专心进行操作,注意观察实验过程中出现的现象和结果,结果不良时,必须重做。
3.实验中,应及时将实验结果如实记录下来,并请老师当场审核。根据实验结果进行科学分析,按时将实验报告交教师评阅。
二、实验时注意事项
1.进实验室要穿好实验服,以免酸碱腐蚀衣服。
2.进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。
3.要保持实验台整洁,试剂、仪器应整齐,按次序放置。实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。
4.实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所,操作务必认真不得敷衍,室内应保持肃静,不得吸烟、玩闹 ,不得随地吐痰,乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。
5.要爱护仪器、节约药品。第一次实验时要按仪器清单清点仪器,负责保管,用后如数交还,在使用时如有破损,及时报告,经指导教师检查后填写破损单,按学校规定赔偿。
6.贵重仪器,如分光光度计、离心机等,要尽力爱护,使用前应熟悉使用方法,严格遵守操作规程,严禁随意开动。
7.要节约水电,一经用完随手关闭水门、电门。
三、值日生任务
1.领发本次所用仪器、物品,清点、交还临时用仪器、物品,若有损坏负责追查赔偿。
2.管理操作公用仪器,打蒸馏水。
3.搞好实验室卫生,做到仪器、桌面、地面、水池……全干净。
4.确保安全:管好仪器、门窗、水电。
5.请任课及技术室老师检查工作,认可后方能离开实验室。
四、试剂使用规则
1.使用试剂前应仔细辨认标签,看清名称及浓度,是否为本实验所需要。
2.取出试剂后,立即将瓶塞盖好,切勿盖错,放回原处。试剂瓶塞、专用吸量管、滴管,不得与试剂瓶分家,以免错用而污染试剂,造成自己或他人实验的失败。未用完的试剂不得倒回瓶内。
3.取标准溶液时,应先将标准液倒入干净试管中,再用清洁吸管吸取标准液,以免污染瓶中的标准溶液。
4.使用滴管时,滴管尖端朝下,切勿倒置,勿使试剂流入橡皮帽内。
5.使用有毒试剂及强酸强碱时,尽可能用量筒量取,若用吸管时只能用吸耳球吸取,切勿用嘴吸取,以免造成意外。
五、废弃物处理
1.所有固体废弃物如:用过的滤纸、棉花、碎屑沉淀物等必须倾弃于垃圾筒中。
2.浓酸必须弃于小钵中,用水稀释后倒入水池中。
3.实验完成后之沉淀或混合物含有可提取之贵重药品者不可随意舍弃,应交教师保存。
实验基本技能
一、消毒和灭菌技术
消毒(disinfection)与灭菌(sterilization)两者的意义有所不同。消毒一般是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体,而灭菌则是指利用强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。但日常生活中两者常常通用。灭菌的方法很多,一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。
1. 物理灭菌
物理灭菌是最常用的灭菌方法。主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭菌等。
(1)热力学灭菌 又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。
①干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快;含水量越小,凝固减慢。因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度更高(160~170℃),时间更长(1~2h)。进行干热灭菌时最高温度不能超过180℃,否则,包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦,甚至引起燃烧。通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱(或称烘箱)进行灭菌,主要用于玻璃器皿如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好或装入特制的灭菌筒内,装入箱中,不要摆的太挤,以免妨碍热空气流通。逐渐加温,使温度上升至160~170℃后保持2h。灭菌结束后,切断电源,自然降温,待箱内温度降至70℃以下后,才能打开箱门,取出灭菌物品。注意在温度降至70℃以前切勿打开箱门,以免玻璃器皿炸裂。
另外,灼烧灭菌也属于干热灭菌。在进行无菌操作时,接种工具如接种环、接种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧,试管口、菌种瓶口在火焰上作短暂灼烧灭菌等。
②湿热灭菌
a.高压蒸汽灭菌 此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度,导致菌体蛋白质凝固变性达到灭菌的目的。
在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三:一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,所需凝固温度降低,二是湿热的穿透力比干热大,三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g水在100℃时,由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压,所以,当水蒸气中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
一般培养基用0.11MPa,121℃,20~30min可达到彻底灭菌的目的。
这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌,也可用于玻璃器皿的灭菌。
b.常压蒸汽灭菌法 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下,常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。对于不易用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌,也可用普通蒸汽笼进行灭菌。由于常压,其温度不超过100℃,仅能使大多数微生物被杀死,而芽孢细菌却不能在短时间内杀死,因此可采用间歇灭以杀死芽孢细菌,达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内,每天加热100℃,30min,连续3d,第一天加热后,其中的营养体被杀死,将培养物取出放室温下18~24h,使其中的芽孢发育成营养体,第二天再加热100℃,30min,发育的营养体又被杀死,但可能仍留有芽孢,故再重复一次,使彻底灭菌。
c.煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10~15min,可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢。如延长煮沸时间,并加入1%碳酸氢钠或2%~5%石炭酸,效果更好。人用注射器和手术器械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌,或采用一次性无菌用品。
d.超高温杀菌 超高温杀菌(ultra high temperature sterilization,简称UHTS)是指在温度和时间标准分别为130~150℃和2~8s的条件下对牛乳或其他液态食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)进行处理的一种工艺,其最大优点是既能杀死产品中的微生物,又能较好地保持食品品质与营养价值。超高温杀菌工艺地应用,使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实。从而打破了地域和季节地限制。
超高温杀菌是自80年代以来已在世界各国广泛应用。我国改革开放以来,
超高温杀菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。
(2)过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热灭菌消毒灭菌方法,均会被热破坏,因此可以采用过滤除菌方法。应用最广泛的过滤器有:
①蔡氏(Seitz)过滤器 该滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属(银或铝)漏斗组成,分上、下两节,过滤时,用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间,然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小滤板分为三种型号:K型最大,作一般澄清用;EK滤孔较小,用来除去一般细菌;EK-S滤孔最小,可阻止大病毒通过,使用时可根据需要选用。
②微孔滤膜过滤器 这是一种新型过滤器,其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。孔径分0.025,0.05,0.10,0.20,0.30,0.45,0.60,0.80,1.00,2.00,3.00,5.00,7.00,8.00和10.00μm。过滤时,液体和小分子物质通过,细菌则被截留在滤膜上。实验室中用于除菌的滤膜孔径一般为0.22μm,但若要将病毒除掉,则需要更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜不仅可以用于除菌,还可以用来测定液体或气体中的微生物,如水的微生物检查。
过滤除菌法应用十分广泛,除实验室用于某些溶液,试剂的除菌外,在微生物工业上所用的大量无菌空气及微生物工作使用的净化工作台,都是根据过滤除菌的原理设计的。
(3)辐射灭菌 紫外线波长在200~300nm,具有杀菌作用,其中以265~266nm杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收,造成细胞损伤而杀菌,紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用较广,无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。此外,采用60Co-γ射线灭菌。也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜,各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是:穿透力强,可在厚包装完好条件下灭菌。
2.化学灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂,如重金属离子等,只是阻抑细菌代谢机能;细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂,如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低,处理微生物的时间长短,微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
微生物实验室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液(来苏尔),0.25%新洁尔
灭,0.1%升汞,3%~5%的甲醛溶液,75%乙醇溶液等。常用化学杀菌剂的配制见附录四。
消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术,而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。
二、无菌操作技术
在微生物的分离和培养过程中,必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作技术,就是在分离、接种、移植等各个操作环节中,必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器或系统内,避免污染培养物。无菌操作技术广泛应用于微生物、组织培养及基因工程等领域。
无菌操作技术,简单的说就是在无菌环境中进行的操作,为保证获得纯净的培养物,需要考虑各种因素的影响。
(1)培养基灭菌
一般采用高压灭菌,将培养基放在高压锅中,排净冷空气后,在121℃灭菌20~30min,保证培养基处于无菌状态。
(2)创造无菌接种环境
无菌操作必须在无菌条件下进行。常见的无菌场所有净化工作台、接种箱和接种室。在进行操作前需将灭菌后的培养基以及接种用的酒精灯、工具等,放到接种场所,然后采用物理或化学方法进行环境处理。
①净化工作台 操作前用75%的酒精棉球擦拭台面,然后打开紫外线灯照射消毒,并打开风机吹20~30min,将台面上含有杂菌的空气排除,保持台面处于无菌状态。
②接种箱 操作前按照每m3空间用10~14ml甲醛和5~10g高锰酸钾进行混合熏蒸,熏蒸时间不少于30min。或用市售气雾消毒剂进行熏蒸,每m3空间用4~5g。接种箱中如有紫外线灯时,同时打开。
③接种室 灭菌方法同接种箱。为避免药害,接种前可以喷洒甲醛用量1/2的氨水来中和残留的甲醛。
(3)手消毒 先用肥皂水洗手,再用75%的酒精棉球擦拭手表面。
(4)工具灭菌 点燃酒精灯,将接种工具在酒精灯外焰上充分灼烧,杀死工具表面附着的杂菌。工具灭菌后不得再接触台面。
(5)无菌操作(以转管为例) 左手拿一支母种和一支空白PDA培养基,右手拿灭菌后的接种构,将两个棉塞同时拔掉,夹在右手的无名指和小拇指、小拇指和掌根之间,不可将棉塞放到台面上。拔掉棉塞后,试管口要在酒精灯火焰上方3~5cm处,利用火焰封口,然后用接种构切取少量母种,迅速通过酒精灯火焰,放到空白培养基斜面中央,轻压以防止滑动。最后塞好棉塞。
(6)培养 将接种后的菌种放到适宜的环境条件下培养。培养环境要注意消毒,防止培养过程中杂菌侵染菌种。
(7)检查 培养过程中要经常检查菌丝生长情况,发现有杂菌污染的菌种要及时挑出。
在进行微生物分离纯化以及其它无菌操作时,要有责任心,培养自己的无菌意识,加强训练,提高熟练程度,降低污染率。
三、玻璃器皿的清冼
清洁的玻璃器皿是得到正确实验结果的先决条件。进行微生物学实验,必须清除器皿上的灰尘、油垢和无机盐等物质,保证不防碍实验的结果。玻璃器皿的清洗应根据实验目的、器皿的种类、盛放的物品、洗涤剂的类别和洁净程度等不同而有所不同。
(一)各种玻璃器皿的洗涤方法:
1. 新玻璃器皿的洗涤 新购置的玻璃器皿含游离碱较多,应先在2%的盐酸溶液或洗涤液内浸泡数小时,然后再用清水冲洗干净。
2. 使用过的玻璃器皿的洗涤方法 试管、培养皿、三角瓶、烧杯等可用试管刷、瓶刷或海绵沾上肥皂、洗衣粉或去粉等洗涤剂刷洗,以除去粘附在皿壁上的灰尘或污垢,然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强,能有效地洗去器皿上的油垢。用去污粉或洗衣粉刷洗之后较难冲洗干净附在器壁上的微小粒子,故要用水多次冲洗或用稀盐酸溶液摇洗一次,再用水冲洗,然后倒置于铁丝框内或洗涤架上,在室内晾干。
含有琼脂培养基的玻璃器皿,要先刮去培养基,然后洗涤。如果琼脂培养基已经干涸,可将器皿放在水中蒸煮,使琼脂溶化后趁热倒出,然后用清水洗涤,并用刷子刷其内壁,以除去壁上的灰尘或污垢。带菌的器皿洗涤前应先在2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液内浸泡24h,或煮沸0.5h,再用清水洗涤。带菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌,然后将培养物倒去,再进行洗涤。盛有液体或固体
培养物的器皿,应先将培养物倒在废液缸中,然后洗涤。不要将培养物直接倒入洗涤槽,否则会阻塞下水道。
玻璃器皿是否洗涤干净,洗涤后若水能在内壁均匀分布成一薄层而不出现水珠,表示油垢完全洗净,若器皿壁上挂有水珠,应用洗涤液浸泡数h,然后再用自来水冲洗干净。盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后即可使用。如果器皿要盛放精确配制的化学试剂或药品,则在用自来水洗涤后,还需用蒸馏水淋洗3次,晾干或烘干后备用。
3. 玻璃吸管 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管(包括毛细吸管),使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内,免得干燥后难以冲洗干净。量筒或标本瓶底部应垫以脱脂棉花,否则吸管投入时容易破损。待实验完毕,再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花,则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接,用水将棉花冲出,然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗,没有吸管自动洗涤器时用蒸馏水淋洗。洗干净后,放搪瓷盘中晾干,若要加速干燥,可放烘箱内烘干。
吸过含有微生物的吸管亦应立即投入盛有2%来苏尔溶液0.25%新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内,24h后方可取出冲洗。
吸管内壁若有油垢,同样应先在洗涤液内浸泡数h,然后再冲洗。 4. 载玻片与盖玻片的清洗 新载玻片和盖玻片应先在2%的盐酸溶液中浸泡1h,然后用自来水冲洗2~3次,用蒸馏水换洗2~3次,洗后烘干冷却或浸于95%酒精中保存备用。
用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油,要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次,使油垢溶解,再在肥皂水中煮沸5~10min,用软布或脱脂棉花擦拭,立即用自来水冲洗,然后在稀洗涤液中浸泡0.5~2h,白开水冲去洗涤剂液,最后再用蒸馏水换洗数次,待干后浸于95%酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮,没有水珠。
检查过活菌的载玻片或盖玻片应在2%来苏尔溶液或0.25%的新洁尔灭溶液中浸泡24h,然后按上述方法洗涤与保存。
(二)洗涤剂的种类及应用
1. 水 水是最主要的洗涤剂,但只能洗去可溶解在水中的沾染物,不溶于水的污物如油、蜡等,必须用其它方法处理以后,再用水洗。要求比较洁净的器皿,清水洗过之后再用蒸馏水洗。
2. 肥皂 肥皂是很好的去污剂。一般肥皂的碱性并不十分强,不会损伤器皿和皮肤,所以洗涤时常用肥皂。使用方法多用湿刷子(试管刷、瓶刷)沾肥皂刷洗容器,再用水洗去肥皂。热的肥皂水(5%)去污能力更强,洗器皿上的油脂很有效。油脂很重的器皿,应先先用纸将油层擦去,然后用肥皂水洗,洗时还可以加热煮沸。
3. 去污粉 去污粉内含有碳酸钠、碳酸镁等,有起泡沫和除油污的作用,有时也加些食盐、硼砂等,以增加摩擦作用。用时将器皿润湿,将去污粉涂在污点上,用布或刷子擦拭,再用水洗去去污粉。一般玻璃器皿、搪瓷器皿等都可以使用去污粉。
4. 洗衣粉 目前我国生产的洗衣粉主要成分是烷基苯磺酸钠,为阴离子表面活性剂。在水中能解离成带有憎水基的阴离子。其去污能力主要是由于在水溶液中能降低水的表面张力,并发生润湿、乳化、分散和起泡等作用。洗衣粉去污能力强,特别能有效地去除油污。用洗衣粉擦拭过的玻璃器皿要充分用自来水漂洗 ,以除净残存的微粒。
5. 洗涤液 通常用的洗涤液是重铬酸钾(或重铬酸钠)的硫酸溶液,是一种强氧化剂,去污能力很强,实验室常用它来洗去玻璃和瓷质器皿上的有机物质。切不可用于金属器皿。
(1)配制
洗涤液的配方一般分浓配方和稀配方两种,可按下列配方来配制: 浓配方:重铬酸钾(工业用) 40.0g 蒸馏水 160.0mL 浓硫酸(粗) 800.0mL 稀配方:重铬酸钾(工业用) 50.0g 蒸馏水 850.0mL 浓硫酸(粗) 100.0mL
配制方法是将重铬酸钾溶解在蒸馏水中(可加热),待冷却后,再慢慢地加入硫酸,边加边搅动。配好后存放备用。此液可用很多次,每次用后倒回原瓶中储存,直至溶液变成青褐色时才失去效用。
(2)原理
重铬酸钾或重铬酸钠与硫酸作用后形成铬酸(chromic acid),铬酸的氧化能力极强,因而此液具有极强的去污作用。
(3)注意事项
① 盛洗涤液的容器应始终加盖,以防氧化变质。玻璃器皿投入洗涤剂之前要尽量干燥,避免洗涤液稀释。如要加快速度,可将洗涤液加热至45~50℃进行洗涤。
② 器皿上有大量的有机质时,不可直接加洗涤液,应尽可能先行清除,再用洗涤液,否则会使洗涤液很快失效。
③ 用洗涤液洗过的器皿,应立即用水冲至无色为止。
④ 洗涤液有强腐蚀性,溅在桌椅上,应立即用水洗或用湿布擦去。皮肤及衣服上沾有洗涤液,应立即用水洗,然后用苏打(碳酸钠)水或氨液洗。
⑤ 洗涤液仅限于玻璃和瓷质器皿的清洗,不适于金属和塑料器皿。
谷氨酸发酵系列实验
一、实验目的
1、掌握发酵工业菌种的制备工艺和质量控制,为发酵实验准备菌种; 2、了解发酵罐的结构,掌握发酵罐的基本操作; 3、掌握谷氨酸发酵的全过程控制及操作; 3、理解和掌握快速测定还原糖含量的方法;
4、理解和掌握快速测定发酵过程谷氨酸含量的方法; 5、掌握用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法。 二、实验原理
谷氨酸产生菌中谷氨酸的生物合成途径如图所示:其中的代谢途径包括糖酵解途径(EMP)、磷酸己糖途径(HMP)、三羧酸循环(TCA循环)、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应(CO2固定反应)等。葡萄糖经过EMP(主要)和HMP途径生成丙酮酸,其中一部分氧化脱羧生成乙酰CoA进入TCA循环,另一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸,草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化下,所合成柠檬酸,再经过氧化还原共扼的氨基化反应生成谷氨酸。由于谷氨酸棒杆菌为生物
素缺陷型突变株,因此在发酵过程中要控制生物素亚适量。 发酵过程控制要点:
发酵初期,菌体生长迟滞,约2~4h后即进入对数生长期,代谢旺盛,糖耗快,这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH 值7.5~8.0,同时保持温度为30~32℃。本阶段主要是菌体生长,几乎不产酸,菌体内生物素含量由丰富转为贫乏,时间约12h。
随后转入谷氨酸合成阶段,此时菌体浓度基本不变,糖与尿素分解后产生的α- 酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH 7.2~7.4,需大量通气,并将温度提高到谷氨酸合成最适温度32~34℃。
发酵后期,菌体衰老,糖耗慢,残糖低,需减少流加尿素量。当营养物质耗尽,谷氨酸浓度不再增加时,及时放罐,发酵周期约为30 h。 三、实验材料、仪器与试剂
1、材料:北京棒杆菌、发酵培养基、谷氨酸发酵液不同发酵时间所取的样品等。
2、仪器:三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、天平、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、显微镜、发酵罐及控制系统、蒸汽发生器、空气压缩机、补料瓶、补料针、硅胶管、滴定管、滴定架、电炉、容量瓶、高速离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液器及枪头、无极调速搅拌机、旋转蒸发器、冰箱等
3、试剂:无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取液、NaCl、NaOH、HCl、KNO3、去离子水、葡萄糖、尿素、消泡剂、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氢化钾、盐酸、L-谷氨酸分析纯、茚三酮、丙酮、酒精等。
4、菌种:北京棒杆菌 四、实验步骤 1、培养基配制
(1)恢复培养基:蛋白胨5g,牛肉膏3g,NaCl 5g,定容至1 L,pH7.0,高压蒸气灭菌锅灭菌:121℃,20 min。
(2)种子培养基:葡萄糖50g,蛋白胨5g,牛肉膏3g,NaCl 5g,定容至1
L,pH7.0,高压蒸气灭菌锅灭菌:121℃,20 min。
(3)发酵培养基:玉米浆2.5g,葡萄糖120g,蛋白胨5g,牛肉膏3g,NaCl 5g,定容至1 L,灭菌:121℃,20min(在线灭菌)。
(4)保藏培养基:蛋白胨5g,牛肉膏3g,NaCl 5g,琼脂15g,定容至1 L,pH7.0,高压蒸气灭菌锅灭菌:121℃,20 min。(只需部分组配制,配制500mL,制成斜面和平板) 2、相关试剂的配制
(1)还原糖含量测定的相关试剂(推荐采用斐林试剂法)
配制方法: 将36.4g CuSO4.5H2O溶于200mL水中,用0.5mL浓硫酸酸化,再用水稀释到500mL待用;取173g酒石酸钾钠KNaC4H4O6.4H2O,71g NaOH固体溶于400mL水中,再稀释到500mL.使用时取等体积两溶液混合.
(2)发酵液谷氨酸含量测定相关试剂(推荐采用茚三酮比色法)
1水合茚三酮试剂:称取 0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中,加入 15 mL 正丙醇,搅拌使其溶解。再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇,最后加入 9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液,混匀,贮于棕色瓶,置 4 ℃下保存备用, 10 d 内有效。 1、酸性茚三酮溶液:称取1.25g 茚三酮溶于30mL 冰乙酸和20mL 6M 磷酸溶液中, 搅拌加热(低于70℃)溶解,冷却后置棕色瓶中,4℃保存可使用2~3 天。
(3)革兰氏染色相关试剂
(1)结晶紫(crystal violet)液:结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL,1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。
(2)卢戈(Lugol)氏碘液:碘0.33g,碘化钾0.66g,蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用,如变为黄色即不能使用。
(3)95%乙醇:用于脱色,脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。
(4)番红溶液:番红O(safranine,又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中,用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可
(3)流加糖:50%葡萄糖,121℃,灭菌20min。 (4)流加氮源:30%尿素,108℃,灭菌5min。
(5)pH调节剂:3mol/LHCl;2mol/LNaOH; 2、菌种制备
将活化后的菌种接种含5mL液体培养基(试管)后置于控温摇床,培养12h,温度为32℃。
取5mL一级种子接种到100mL二级种子培养基中,置于控温摇床200 r/min,震荡培养7~8h,温度为32~33℃。时间以OD净增0.5为准。 3、发酵培养基的制备、灭菌及接种
清洗好发酵罐,对发酵罐进行空消,加入2L的发酵培养基,对发酵罐进行实消,在接种槽中加好酒精并点燃,把种子培养基从接种口倒进发酵罐中进行发酵。
5、发酵过程控制
(1)温度:0~12h温度为30~32℃,发酵12h后为34~36℃.
(2)pH:7.0~7.2 发酵结束前4小时控制在6.7,pH利用30%尿素控制。 (3)通风量(多级控制0~12h,逐渐增加,12~24维持,24~30逐渐降低) (4)菌体生长情况及形态观察
吸取0.5ml发酵液于1.5ml离心管中,8000r/min离心3min,吸取0.1ml上清液于比色管后,弃去离心管剩余的上清夜,沉淀用蒸馏水稀释100倍,经过混匀后,用722光栅分光光度计在620nm波光下测其OD值,菌种OD值可以反映菌体的浓度,通过菌体浓度可以知道菌种生长情况。
(5)发酵液中残糖量测定及控制(0h开始,每间隔2 h测一次,当残糖降至5%时,开始按40mL/h的速度进行补糖,此后可不测,至26h,28h再测二次)
(6)发酵液谷氨酸含量测定(10h开始,每间隔4h测一次)
谷氨酸发酵液11400r/min,离心5min,取上清,蒸馏水稀释100倍,调节pH值5.5-6,取3ml预处理好的发酵液加入15mm×150mm试管,调整pH值5.5左右,沿试管壁加入0.5ml茚三酮试剂,混匀,迅速置于80℃水浴,3min后,冰浴3min,将分光光度计波长调至569nm处,以100稀释的空白发酵培养基为空白对照,用1cm玻璃比色皿比色,测出OD569值。从标准曲线上查出相应L-谷氨酸浓度。
(7)发酵周期:30 h 6、发酵液中谷氨酸的提取回收
(1)发酵液中菌体和蛋白的去除
各小组收500mL发酵液至于低速离心机中,2000rpm/min,离心10min,收集上清液;
(2)粗提:向上述上清液中边搅拌边缓慢加入50%硫酸至pH4.5左右,投入少许谷氨酸,停搅拌育晶1h,继续边搅拌边缓慢加入50%硫酸至pH3.0左右,搅拌过液,4000rpm/min,离心10min,收集谷氨酸沉淀于培养皿中,置于50℃烘箱中烘至恒重,并计算提取率。 五、实验结果及分析 1、按表1完成发酵过程记录
表1 谷氨酸发酵实验记录表
2、计算发酵过程的技术指标:糖酸转化率、产酸率及单罐产量。 3、计算发酵液谷氨酸的提取率。 4、分析发酵过程控制的关键。 5、附上各个时期的细胞形态图
六、思考题
1. 实验中如何保证无菌条件?
2. 发酵罐培养基灭菌,蒸汽从哪里进入,哪里排出?如何操作? 3. 为了达到要求的灭菌后体积,灭菌前的培养基体积应如何确定? 4. 接种量如何计算?如果10 L培养液要求接种量10%,种子应培养多少? 5. 采取调节通气量或转速来提高溶氧,哪种方法效果更显著? 6. 糖消耗与菌体生长、尿素消耗有什么相关性? 7. 在分批培养中菌生长速率有什么特点?