分子生物学实验-2013

实验一 植物基因组DNA 的提取及其定性定量分析

【实验目的】

通过本实验学习利用CTAB 法从植物组织中提取DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分

光光度法对DNA 进行定性定量分析。

【实验原理】

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) 是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度

下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB 缓冲液将DNA 溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA 。

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA 样品加入到一块包含电

解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶) 的样品孔中，并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点

的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效

应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA 分子比分子量大的DNA 分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。

核酸分子(DNA或RNA) 由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异

的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml ，ssDNA 33 μg/ml 和ssRNA 40 μg/ml 。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA 的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA 污染，低于1.8则有蛋白质污染。

【仪器设备】

离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系

统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪。

【实验步骤】

1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 ml EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。

2. 加入0.6 ml 2×CTAB 提取液(用前加入0.2﹪的巯基乙醇) ，混匀，65℃ 水浴30 min，

每10 min颠倒混匀一次。

3. 取出离心管，冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液，混匀。

4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次) 。

5. 将上清液(约400 μl) 转移到另一新的1.5 ml离心管中。

6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 ul) 。

7. 加入600 μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。

8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。

9. 1 ml 70％乙醇(预冷) 洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能Vertex ，7,000 g离心3 min，

弃上清，风干。

10. 加入30 μl 无菌水(含20 μg/ml RNase A)，37℃ 溶解DNA 30 min。

11. 取5 μl DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：

(1) 制备琼脂糖凝胶

称取0.24 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 ml 0.5× TBE缓冲液，置微波炉中加热至

完全熔化，取出摇匀，则为0.8％琼脂糖凝胶液。

(2) 胶板的制备

① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一

定封严，不能留缝隙），形成一个模具。

② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。

③ 待琼脂糖凝胶液冷却到60℃ 左右时，加入核酸染料1.5 μl ，摇匀，缓缓倒入有机玻

璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

④ 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将

凝胶及内槽放入电泳槽中。

⑤ 加入0.5× TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。

(3) 加样

在点样板或parafilm 上混合DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不

小于1×。用10 μl 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。

(4) 电泳

① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移

动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。

② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm 处，停止电泳。

③ 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。

12. 紫外分光光度法测定DNA 浓度及纯度：

(1) 用0.1×TE 对待测DNA 样品按1:20或合适的倍数稀释。

(2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”

时，进入核酸测定窗口。

(3) 调零。先用0.1×TE 缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，

仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

(4) 吸70 μl 已稀释的DNA 样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很

少，可以用5-7 μl 的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260 nm 和280 nm处的光密度（OD 值）及A260/A280 nm和A280/A260 nm的比率以及DNA 样品的浓度等。

(5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加

入下一个待测样品。

(6) DNA纯度：以A260/ A280比值来反映。当A260 /A280比值

蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE 溶解后再测定。当A260/A280比值>2.0，说明样品存在RNA 污染，可以用RNA 酶处理样品去除RNA 。

【实验结果】 ：

实验二 PCR 扩增目的片段

【实验目的】

通过本实验学习PCR 反应的基本原理与实验技术。

【实验原理】

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR ）是一种体外核酸扩增系统，其原理

类似DNA 分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA 片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增2n 倍。

典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP 、两个合成的

DNA 引物、耐热DNA 聚合酶。PCR 的工作程序实际上是一个在模板DNA 、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步：① 变性，加热使模板DNA 双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段；② 退火，快速降低温度至50-60℃ 后，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段；③ 延伸，溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP) ，按5′→3′方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA 量就增加一倍，新形成的DNA 链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA 可扩增106-109倍。PCR 扩增的特异性取决于引物与模板DNA 的结合。

【仪器设备】

PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统。

【实验步骤】

1．在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系：

反应物 体积/μl

ddH 2O 11.3

10×PCR 缓冲液 2.0

dNTP 1.6（终浓度20—200 μM）

引物1 2.0（引物终浓度0.2 μM）

引物2 2.0（引物终浓度0.2 μM）

模板DNA 1.0

rTaq 酶 0.1

Total 20

视PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2. 将上述试剂依次加入PCR 薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反

应成分集于管底。

3. PCR反应热循环程序设置：

① 94 ℃ 预变性 3 min;

② 94 ℃ 变性 30 sec;

③ 64 ℃ 退火 30 sec; 30 cycles

④ 72 ℃ 延伸 1 min;

⑤ 72 ℃ 延伸 10min;

⑥ 16℃ pause

反应结束后短暂离心，置4℃ 保存备用。

4. 配制0.8％的琼脂糖凝胶。

5. 取5 μl PCR产物，加1 μl 的6×loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。

6. 如果PCR 产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。

【实验结果】

本实验扩增片段长430 bp左右。

实验三 目的片段和载体的连接

【实验目的】

通过本实验掌握DNA 重组连接方法。

【实验原理】

外源DNA 与载体分子的连接就是DNA 重组，这种重新组合的DNA 叫做重组子。DNA

重组本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA 连接酶催化两个双链DNA 片段的5′端磷酸和3′端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。

pMD19-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物(TA Cloning) 的专用载体。它含有Amp 抗

性基因、β半乳糖苷酶的启动子和编码其N 端氨基酸(α肽链) 的片断基因，在这段基因中插入一个多克隆位点（DNA 载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA 提供多种可插入的位置或插入方案），其中有EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3′端添加“T”而成。这款载体含有的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30 min）完成连接反应，连接反应的温度在37℃ 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度12-16℃，最多可以连接12-16hr （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

【仪器设备】

移液器、吸头、恒温水浴锅。

【实验步骤】

1. 在灭菌的Eppendorf 管中，加入：

pMD-19 T载体 0.5 μl

目的PCR 片段 4.5 μl

Solution 5 μl

共10 μl 体系，混匀，16℃ 连接过夜（12-16hr ）或室温（20-25℃）连接10 min。

DNA 片段的摩尔数应控制在载体DNA 摩尔数的3-10倍。

2. 盖好盖子，用手指轻弹EP 管数次，并于台式离心机离心2 sec以集中溶液。

3. 将反应管放入16℃ 连接过夜（12～16hr ）。

4. 取出约25 ng 的DNA 连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质

粒DNA 片段和PCR 片段为对照进行电泳检测。

【实验结果】 ：

实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测

【实验目的】

通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

【实验原理】

体外连接的重组DNA 分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。

研究发现，用含Ca 2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会使细胞易于吸收外源DNA 。大肠杆菌吸收外源DNA 的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA 的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCl 2法。

CaCl 2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl 2

低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA 附着于细胞膜表面，经42°C 短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物。

本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl 2处理受体菌使其处于感受态，之后通

过转化实验检测感受态细胞的转化效率。

【仪器设备】

台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅、超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温

箱。

【实验步骤】

1. 从大肠杆菌DH5α 平板上挑取一个单菌落接于2 ml LB液体培养基的试管中，37 ℃

210 rpm 振荡培养过夜。

2. 次日，按1:100(V/V)，即取1 ml菌液转接到一个含有100 ml LB液体培养基锥形瓶中，

37 ℃ 振荡培养2-3 hr。（此时，OD 600 ≤ 0.3-0.5，此为实验成功的关键）。

3. 将菌液转移到50 ml冰浴好的离心管中，冰上放置10 min。

4. 4 ℃，3,500 rpm/min，离心10 min，回收细胞。

5. 倒出培养液，将管倒置，以便培养液流尽。

6. 将菌体重悬于1/10体积的终浓度为20 mM CaCl2 和 80 mM MgCl2的混合溶液中。（务

必放冰上）。

7. 4 ℃，3,500 rpm/min，离心10 min，回收细胞。

8. 将菌体重悬于1/50体积冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液中（务必放冰上）。此细胞为感受

态细胞。于4℃冰箱中保存，一周内使用或将菌体悬浮于1/50体积冰冷的含有15%甘油的

0.1 mol/L CaCl2溶液中，分装，每100 μl 一份，液氮速冻，置于-80℃。

【实验结果】 ：

实验五 重组质粒的转化

【实验目的】

通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。

【实验原理】

转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化缓冲液中的DNA

形成不易被DNA 酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于感受态细胞表面。42℃ 短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp 抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃ 培养过夜形成单克隆。在这个过程中包

含两种筛选方法，一种是抗性筛选，一种是蓝白斑筛选。载体中含有耐药基因，可以使转化成功的受体细胞具有抗药性，能够在含有相应药物的琼脂平板上形成单克隆菌落。通过这种方法就可以筛选转化成功的受体细胞。而能进行蓝白筛选是因为载体中有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子和编码其N 端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C 端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。在诱导物IPTG （乳糖类似物，不会被β-半乳糖苷酶摧化降解）的作用下，由α互补形成的具有功能活性的β-半乳糖苷酶，可分解培养物中的X-gal （它能将无色的化合物X-gal 切割成半乳糖和蓝色底物），使其呈蓝色反应 。如果外源基因插入位于LacZ 基因内部的多克隆酶切位点中，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β-半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，导致不能编码β-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。而没有插入外源片断的则是蓝色的。因此，按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了外源基因。

【仪器设备】

超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴器。

【实验步骤】

1. 取实验三重组质粒10 μl 加入100 μl 感受态细胞，混匀（轻弹，感受态很脆弱），冰

浴30 min（静置，勿动，确保DNA 吸附在感受态细胞表面）。

2. 将管放到42 ℃ 水浴锅中，热激90 sec（准确，防止LB 液体进入细胞中）。

3. 冰浴2 min（使得感受态细胞膜收缩，磷脂双分子层的运动）。

4. 加500 μl LB 液体培养基（在超净台中进行），轻轻混匀。

5. 37 ℃ 温育45 min ，130 rpm慢摇（必须保证前20 min的转速，因为大肠杆菌20 min

繁殖一代，第一代的细胞较脆弱，防止细胞破碎）。

6. 在预制的LB 琼脂平板上，加40 μl 20 mg/ml X-gal 和16 μl 50 mg/ml IPTG 溶液。

7. 用灭菌玻璃棒（酒精灯上烧后冷却）均匀涂布。

8. 37 ℃ 温箱中放置30 min（使有毒物质挥发）。

9. 3,500 rpm，离心2 min。

10. 弃约500 μl 上清，将剩余菌液轻轻吹打混匀涂于含有氨苄青霉素的LB 平板上，晾

至液体被吸收。

11. 倒置平皿37 ℃ 培养12-16hr ，出现单菌落（培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，

其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落）。

【实验结果】 ：

实验六 菌落的PCR 鉴定

【实验目的】

通过本实验学习菌落PCR 的基本原理与实验技术。

【实验原理】

重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR 方法对重组子进一步进行快速鉴定。用灭菌后的牙签轻轻粘取白色菌落的部分菌体，在准备好的双蒸水中洗涮一下，充分混匀，取一定量加入PCR 反应体系，在PCR 反应循环中，95℃ 加热可以使细菌破裂，释放出重组质粒作为PCR 扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。

【仪器设备】

一、仪器及耗材

PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统。

二、试剂

1. 10 × 缓冲液

2. DNA 模板 （以菌体热解后暴露的DNA 为模板）

3. dNTP Mix

4. 引物

P3： 5′-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3′ P5： 5′-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3′ 引物溶液浓度：2 μM

5. rTaq 酶 5 U/μl

6. 去离子水或TE （pH7.6）

【实验步骤】

用200 μl 的枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 μl 无菌水中，从中取2 μl 菌液作为菌落PCR 模板。

1．在200 μl PCR 管内配制20 μl 反应体系：

反应物 体积/μl

ddH 2O 10.3

10×PCR 缓冲液 2.0

dNTP 1.6

引物１ 2.0

引物2 2.0

菌液 2.0

rTaq 酶 0.1

Total 20 ul

视PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2. 将上述试剂依次加入PCR 薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反 应成分集于管底。

3. PCR反应热循环程序设置：

① 94 ℃ 预变性 3 min;

② 94 ℃ 变性 30 sec;

③ 64 ℃ 退火 30 sec; 30 cycles

④ 72 ℃ 延伸 1 min;

⑤ 72 ℃ 延伸 3 min;

⑥ 16 ℃ pause

反应结束后短暂离心，置4℃ 保存备用。

4. 配制0.8％的琼脂糖凝胶。

5. 取5 μl PCR产物，加1 μl 的6×loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。

【实验结果】

本实验扩增片段长430 bp。

实验七 重组质粒DNA 的提取及酶切鉴定

【实验原理】

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA ，大小范围从1 kb至200 kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

一般分离质粒DNA 的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA 。分离制备质粒DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS 法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。

碱裂解法提取质粒DNA 是根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA 。在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，在这样的条件下，尽管共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA 。

限制性内切酶是一类能识别双链DNA 分子中特异核苷酸序列的DNA 水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4-8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，识别序列越长，在同一DNA 分子中识别位点出现的频率就越小。限制性内切酶主要用于基因组DNA 的片段化、重组DNA 分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA 分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。本实验以EcoR Ⅰ和Hind III对本实验中提取的重组质粒进行小量酶切鉴定。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。

【仪器设备】

一、仪器及耗材

恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅。

二、试剂

1. 质粒提取试剂盒（Takara ）

2. EcoRⅠ和Hind III.限制性内切核酸酶

3. 内切酶反应缓冲液

4. 琼脂糖凝胶电泳相关试剂

【实验步骤】

1. 将实验六第一步剩余的13 μl 菌液接于2 ml 含Amp ( 50 μg/ml )的LB 液体培养基中37 ℃ 振荡（225 rpm）培养过夜。

2. 取1.5 ml的过夜培养菌液，12,000 rpm离心2 min，弃上清，尽可能除去细菌沉淀里残留的液体培养基。

3. 用250 μl 的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。

注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（vortex ）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。

4. 加入250 μl 的Solution Ⅱ 轻轻地上下翻转混匀5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。

注：此步骤不宜超过5 min。

5. 加入400 μl 的4℃ 预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2 min。

6. 室温12,000 rpm离心10 min，取上清。

注：此时4℃ 离心不利于沉淀沉降。

7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

9. 将500 μl 的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。

10. 将700 μl 的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。 注：请确认Rinse B中加入了指定体积的100%乙醇。

11. 重复步骤10。

12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1 min。

13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 μl

的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min。

注：把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃ 使用时有利于提高洗脱率。

14. 12,000 rpm离心1 min洗脱DNA 。

15. 取5 μl 样品于0.8％琼脂糖凝进行电泳（100V ，25 min）检测。

16. 冰浴或-20 ℃ 保存。

17. 构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5 ml PCR 薄壁离心管中进行。

在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl ）

ddH 2O 9 μl

重组质粒 8 μl （本实验提取的重组质粒DNA ）

10×Green Buffer 2 μl

Nco Ⅰ 0.5 μl

Bcu I 0.5 μl

Total 20 μl

限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀，3,000 rpm离心15sec 。37℃ 水浴温育90 min。

18. 取20 μl 酶切产物，加入4 μl 6×上样缓冲液，混匀后0.8%凝胶电泳观察实验结果。

【实验结果】 ：