应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA方法

中国农业科学 2006,39(1):181-186 Scientia Agricultura Sinica

应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA 方法

辛九庆，高玉龙，李 媛，王砚范，钱爱东

(1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所／国家牛传染性胸膜肺炎参考实验室，哈尔滨 150001；2吉林农业大学动物科技学院，长春 130118)

1

1

1

1

2

摘要：【目的】丝状支原体丝状亚种SC（Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC，MmmSC）是引起牛传染性胸膜肺炎（contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）的病原体。成熟的脂蛋白LppQ N端是亲水性的，在自然感染和人工感染时，特异性免疫反应产生早，持续时间长，抗体滴度高，因此有理由相信脂蛋白LppQ N 端片段将有可能成为一种理想的CBPP 诊断抗原。【方法】由于TGA 密码子在支原体中编码色氨酸（Trp），而在细菌中则为终止密码子，故利用一步重叠延伸PCR 突变方法体外诱变中国生产抗原用毒株HVRI Ⅹ的lppQ 基因进行原核表达，利用重组抗原建立间接ELISA 方法。【结果】序列分析表明，将lppQ 基因第198位的A 成功突变为G， 并将突变后的脂蛋白LppQ N端基因片段插入原核表达载体pET32a 的多克隆位点，构建了原核表达载体。重组菌经诱导后，表达出了分子量约为42 kD、带有6个组氨酸标签的重组融合蛋白，纯化后蛋白质纯度高达95%，Western blot 结果显示，重组蛋白具有很好的免疫活性。将纯化的蛋白质稀释至0.35 µg ·ml -1，包被酶标反应板，优化反应条件，P/N为4.8（0.934/0.193）。应用TG-ROC 统计软件分析确定阴阳性血清临界OD 值为0.376，敏感性为95.8%（46/48）， 特异性为98.9%（161/163）。应用间接ELISA 和补体结合试验（CFT）对来自3个省自治区3 817头份牛血清进行了检测。【结论】Kappa值为0.63，两种方法存在中、高度一致性。

关键词：牛；牛传染性胸膜肺炎；脂蛋白LppQ；突变；ELISA

Development of an Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Contagious Bovine Pleuropneumonia Using Recombination Lipoprotein LppQ of Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC

XIN Jiu-qing1，GAO Yu-long1，LI Yuan1，WANG Yan-fan1，QIAN Ai-dong2

(1National Reference Laboratory of Contagious Bovine Pleuropneumonia, Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy

of Agricultural Sciences, Harbin 150001; 2College of Animal Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118)

Abstract : 【Objective 】Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC (MmmSC) is the etiological agent of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP). The N-terminal domain of the mature lipoprotein LppQ is hydrophobic, and it induces a strong, specific, early and persistent immune response in naturally and experimentally infected animals. People have good reason to believe N-terminal fragment of lipoprotein LppQ will become a kind of ideal CBPP diagnosis antigen.【Method 】Mycoplasma–specific TGA (Trp) codons are utilized as stop codons in most other organisms. The lppQ N-terminal fragment from MmmSC HVRI X strain was mutated with a one-step overlapping extension PCR, and was expressed in E. coli. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay was established by using recombination lipoprotein LppQ 【Result 】Sequence analysis confirmed the successful mutation from A to G in codon 198 in the lppQ gene. The fragment containing the mutation site was subcloned into the pET32a expression vector. The recombinant protein with molecular weight of 42kD was purified by Ni-NTA His·Bind purification kit and the purity up to 95%. Western blot indicated that the standard positive serum of CBPP could react with the recombinant protein. The purified protein was diluted to 0.35 μg·ml-1, and coated to microtiter ELISA plates. Indirect ELISA reaction conditions were optimized. The value of P/N was determined to be 4.8 (0.934/0.193), the sensitivity to be 95.8% (46/48), and the specificity to be 98.9% (161/163). A total of 3 817 bovine serum samples were detected by indirect ELISA and CFT. 【Conclusion 】The Kappa value is 0.63, which is middle or

收稿日期：2005-03-03；接受日期：2005-11-26

基金项目：国家“十五”科技攻关重大专项基金项目（2002BA518A04）

作者简介：辛九庆(1970-)，男，黑龙江哈尔滨人，副研究员，博士研究生，研究方向为动物分子流行病学与诊断学。Tel: 0451-85935091；Fax:

0451-82733132；E-mail: [email protected]。

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high agreemen between the two methods.

Keywords : Bovine; Contagious bovine pleuropneumonia; Lipoprotein LppQ; Mutagenesis; Indirect enzyme-linked

immunosorbent assay

0 引言

【本研究的重要意义】牛传染性胸膜肺炎（contagious bovine pleuropneumonia，CBPP ）又称牛肺疫，是由丝状支原体丝状亚种SC （Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC，MmmSC ）引起的一种烈性传染病。该病在20世纪50～70年代给中国养牛业造成重大经济损失，通过大面积免疫以及采用检疫、隔离、扑杀等综合防治措施，在80年代死亡头数降到1595头。在1989年扑杀最后一头牛肺疫病牛后，中国已无发病牛和死亡牛的报道。1992～1996年，进行了全国性牛肺疫流行情况调查。如果要得到世界动物卫生组织（OIE ）的无病认证，必须补充相关的技术资料。根据OIE 有关技术规定，中国主要采用国际参考实验室提供的标准抗原应用补体结合试验（complement fixation test，CFT ）进行血清学筛查，由于CFT 试验本身存在一些无法避免的缺点，急需一种准确、快速、方便的血清学诊断方法。【前人研究进展】1765年Bourgelat 最先描述CBPP 临床症状；1736年英国的Barker 根据肺部病变将CBPP 与其它疾病区别开；直到1773年才真正发现和认识了CBPP 并对感染的牛进行扑杀来控制本病[14]。El-Mostafa Abdo 和Georges Rawadi[2,3]对脂蛋白LppQ （lipoprotein LppQ）免疫原性进行了研究，结果显示在自然和试验感染牛体内，该蛋白特异性免疫反应产生早，持续时间长，抗体滴度高。蛋白质功能区域研究结果表明，编码脂蛋白LppQ 基因N 末端富含亲水性氨基酸，暴露于表面，相反其C 末端富含疏水性氨基酸，是一种膜内结构，不具有免疫原性。Rosario Gonçalves[4]研究表明该蛋白质存在于MmmSC 非洲株、欧洲株和疫苗株中，而在丝状支原体簇的其它成员中未发现。EL-Mostafa Abdo [5]认为脂蛋白LppQ N端片段将有可能成为一种理想的CBPP 诊断抗原。Bruderer [6]等应用重组的脂蛋白LppQ N端建立了间接ELISA 方法，显示出很好的敏感性和特异性。【本研究切入点】中国从上个世纪50年代开始在全国大面积使用弱毒疫苗免疫，成功控制了CBPP 在中国的流行。90年代以后则采取检疫、扑杀、隔离的措施力图消灭CBPP 。在1992年开始进

行的全国性监测中，主要使用国产补体结合试验和微量凝集试验进行血清学检测并结合临床、病理和病原 分离等技术手段。建立敏感、特异、快速的诊断技术对于进行流行病学调查和口岸隔离检疫是非常必须的。在国际贸易中，OIE 指定的血清学试验是CFT ，但由于CFT 试验操作复杂，抗体检出时间短等原因，世界各国学者都在寻求建立一种简单、实用、灵敏、特异的诊断方法。基于体外表达的LppQ 蛋白建立的间接ELISA 方法将成为最有前途的诊断技术。由于lppQ 基因中存在至少3个编码色氨酸（Trp ）的TGA 密码子，而该密码子在细菌中则为终止密码子，能否只突变其中一个TGA 密码子在体外表达部分基因后用于ELISA 试验成为本研究的关键。【拟解决的关键问题】利用中国生产抗原用菌株HVRI Ⅹ株，通过一步重叠延伸PCR 突变方法体外诱变TGA 密码子，表达脂蛋白LppQ N端，使之以可溶性形式存在。选择最佳包被浓度，利用已知阴、阳性血清确定临界值，建立间接ELISA 方法。

1 材料与方法

1.1 菌株

MmmSC HVRI Ⅹ菌株由国家牛传染性胸膜肺炎参考实验室保存。

1.2 载体及受体菌

pUC18载体购自TaKaRa 公司，受体菌JM83由哈尔滨兽医研究所刘思国博士惠赠。 1.3 工具酶与主要试剂

小量DNA 胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；Pyrobest TM 高保真DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker 购自TaKaRa 公司；限制性内切酶Eco RI 和Sal I 购自Sangon 公司。BugBuster TM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒购自Navagen 公司。HRP-兔抗牛IgG 酶标结合物购自Sigma 公司。

1.4 国际补体结合试验抗原及标准血清

来自于葡萄牙国家兽医实验室（OIE 指定的牛传染性胸膜肺炎参考实验室）Jose Regalla教授。 1.5 阳性血清与阴性血清

48份人工感染CBPP 牛血清由哈尔滨兽医研究所

1期 辛九庆等: 应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA 方法 183

吴裕祥教授惠赠；163份假定阴性血清来自近15年从未发生过CBPP 地区的健康牛血清。

1.6 色氨酸遗传密码子的突变与表达载体构建

编码脂蛋白LppQ 的lppQ 基因包含多个TGA 密码子，在支原体中被编码为色氨酸（Trp ），而在其它微生物中则为终止密码子。脂蛋白LppQ N末端第196-198位是TGA ，为了在大肠杆菌中表达脂蛋白LppQ ，参照Urban 等描述的一步重叠延伸PCR 突变

方法（OOE-PCR ）[7，8]，将第198位的A 突变为G （编

码Trp ），并将突变后的N 末端基因插入原核表达载体pET32a 的多克隆位点，构建了脂蛋白LppQ N末端原核表达载体。为此设计了两对引物，其中一对为：上游引物（P1）:

5′-gcggaattcAATGAAAAATAAACATATCAGTC -3′, 其5′端设计有Eco RI 位点；

下游引物（P2）: 5′-gacgtcgacATTAAAGTT TCTA GCTTGTTG-3′，其5′端设计有Sal I 位点。

还有一对突变引物B: 5′-CAAAAAATGAGT ′ 突变引物C: 5′-TCT TGTTT ′，另外还利用了pUC18和pUC19通用引物A: 5′-CAGCACTGACCCTTTTGG GACCGC-3′。 引物B 和C 的下划线标出基因突变的位置。引物由上海Sangon 公司合并经过HPLC 纯化。 1.7 lppQ 基因N 末端的表达及纯化

使用培养基按常规方法进行蛋白质诱导表达，应用SDS-PAGE 检测蛋白表达情况，确定蛋白存在形式；按BugBuster TM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒纯化试剂盒操作手册说明在自然条件下对目的蛋白进行纯化，分管收集蛋白洗脱液，用SDS-PAGE 分析纯度。 1.8 重组表达蛋白质活性检测

应用从葡萄牙里斯本OIE 指定的牛传染性胸膜肺炎参考实验室进口的CBPP 阳性血清，HRP-兔抗牛IgG 酶标结合物进行Western blot分析，以检测表达目的蛋白的免疫活性。

1.9 ELISA反应条件的确定

利用方阵滴定试验确定抗原包被浓度、血清稀释度和作用时间、二抗稀释度和作用时间等反应参数。 1.10 ELISA 敏感性和特异性试验

利用确定的ELISA 反应参数检测人工感染CBPP 牛血清和来自于无CBPP 地区的健康牛血清，应用TG-ROC 统计软件（由Geiger 博士惠赠）[9，10]确定临界值，评价敏感性和特异性。

1.11 ELISA反应的交叉反应性

利用口蹄疫、牛结核病和牛流行热阳性血清来评价间接ELISA 的交叉反应性。3种阳性血清分别由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相关研究室提供。

1.12 ELISA检测方法的应用

应用本研究建立的间接ELISA 方法对对送检的 3 817份牛血清进行检测，并与国际标准的CFT 检测结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 色氨酸遗传密码子突变与表达载体构建

通过对突变后的lppQ N末端序列进行序列测定显示，其198位的A 成功地被突变为G ，而其它部位的序列未发现改变。将此突变基因克隆到pET32a 载体中，对获得阳性克隆测序表明，读码框架正确。 2.2 重组蛋白的表达与纯化

阳性重组质粒在大肠杆菌中诱导后，出现目的融合蛋白，大小约42 kD，而非诱导对照在42 kD附近未出现蛋白条带。通过对表达条件的优化，目的蛋白可占菌体总蛋白的53.7%（图1）。表达产物经超声波破碎后，用SDS-PAGE 分析表明，融合蛋白主要以可溶形式存在。分管收集蛋白洗脱液（Elute Buffer），用SDS-PAGE 分析结果表明，蛋白纯度可达95%以上（图2），用考马斯亮蓝G-250检测试剂（Bradford 法）检测蛋白浓度，第1、2管蛋白浓度在300～400 μg·ml-1，从第3管开始蛋白含量逐渐降低。 2.3 表达蛋白质免疫活性的检测

Western blot结果显示，在大约42 kD位置左右出

1 2 3 4 5 6 M

kD 66.045.036.024.0 20.1

1. 未诱导细菌；2～6. 分别是1.2、1.0、0.8、0.4、0.2 mmol·L-1 的IPTG ；M. 蛋白质marker

1. Uninduced bacteria; 2-6. Induced with 1.2, 1.0, 0.8, 0.4, 0.2 mmol·L-1 IPTG

, respectively; M. Protein marker

图1 不同IPTG 浓度诱导表达目的蛋白SDS-PAGE 分析 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of expressed recombinant protein

after induction by different concentrations of IPTG

184 中 国 农 业 科 学

39卷

1 2 M 3 4 5 6 7 8 9

42 kD

1. 纯化前的重组蛋白；2. 洗涤液；3～9分别是洗脱液的7管纯化蛋白；M. 蛋白质marker

1. Recombinant protein before purification; 2. Wash buffer; 3-9. Purified recombinant protein in Elute 1 to 7, respectively; M. Protein marker

图2 表达目的蛋白纯化后SDS-PAGE 分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified protein

现特异性的目的条带，表明重组脂蛋白LppQ 在大肠杆菌中得到了正确表达并具有良好的免疫原性（图3）。

2.4 ELISA反应条件的确定

利用纯化的重组蛋白质包被ELISA 反应板，蛋白质用Ph 9.6，0.05 mol·L-1的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度0.35 μg·ml-1，100 µl/孔4℃过夜。方阵滴定试验最终确定了反应程序：用PBST （含0.05%吐温-20/PBS缓冲液，pH 7.4）洗板3次，每孔加100 μl 3%鱼明胶，37℃封闭90 min；洗板3次，每孔加1∶80稀释的待检血清100 μl ，37℃作用30 min；洗板3次，每孔加

1 2

kD

66.0 45.0 42 kD

36.0 29.0 24.0 20.10 14.20

1. 蛋白质marker ；2. 重组蛋白

1. Protein marker; 2. Recombinant protein

图3 表达目的蛋白的Western blot检测 Fig. 3 Western blot analysis of recombinant protein

1∶2 000稀释的二抗100 μl ，37℃作用60 min；洗板3次，每孔加100 μl OPD，暗盒作用30 min后，每孔

加50 μl 终止液，测OD 值。 2.5 临界值的确定

对48份阳性血清和98份假定阴性血清的OD 值进行分析，48份阳性血清OD 算术平均值为44.85/48=0.934，98份假定阴性血清OD 算术平均值为18.882/98=0.193，P/N（0.934/0.193）=4.8。应用TG-ROC 统计软件分析阴阳性血清临界OD 值，最终确定为0.376，即OD 读数大于0.376为CBPP 血清学阳性，小于0.376为CBPP 血清学阴性。敏感性为：46/48=95.8% 特异性为：161/163=98.9%。 2.6 ELISA反应的交叉反应性

按照确定的ELISA 反应条件对口蹄疫、牛结核病和牛流行热阳性血清进行检测。结果显示，3种血清的OD 值均在阴性判定标准范围内。 2.7 ELISA检测方法的应用

分别应用CFT 和本研究建立的ELISA 方法对来自3个省自治区的3 817份牛血清进行检测（表），其中西藏自治区CFT 阳性的7份样品在ELISA 检测中有5份为阳性，其余则为阴性；云南省CFT 阳性的3

表 CFT和间接ELISA 试验检测3 817头份牛血清结果 Table The results of 3 817 bovine serum samples detected

by CFT and indirect ELISA

阳性 阴性 Positive

Negative

间接ELISA 试验 西藏自治区(2 000头份) 17 1983

Result of indirect- 2 000 samples from ELISA

Tibet Municipality 云南省(811头份) 5 806

811 samples from Yunnan Province 贵州省(1006头份) 4 1002

1 006 samples from Guizhou Province 合计(3 817头份) 26 3791 Total 3 817 samples 补体结合试验 西藏自治区(2 000头份) 7 1993

Result of CFT

2 000 samples from Tibet Municipality 云南省(811头份) 3 808

811 samples from Yunnan Province 贵州省(1 006头份) 2 1004

1 006 samples from Guizhou Province 合计(3 817头份) 12 3805

Total 3 817 samples

1期 辛九庆等: 应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA 方法 185

份样品在ELISA 检测中皆为阳性；同样贵州省CFT 阳性的2份样品在ELISA 检测中也皆为阳性。根据生物统计原理，计算Kappa 值为0.63，为中高度一致。

3 讨论

对于CBPP 的血清学诊断，在超过半个世纪的时间里，报道了几种血清学方法，其中包括玻片凝集试验（SAT ）、补体结合试验（CFT ）、琼脂扩散试验（AGP ）、被动血凝抑制试验（PHA ）和微量凝集试验（MA ），但同时这些试验的局限性也已经得到证 实[11]。虽然CFT 仍然被OIE 指定为CBPP 法定诊断方法[12]，在欧洲广泛应用，但利用重组抗原建立的间接ELISA 方法和利用单抗建立的竞争ELISA 方法逐渐显示出其本身的优越性[13，14]。脂蛋白LppQ 存在于MmmSC 非洲株、欧洲株和疫苗株中，而与丝状支原体簇的其它成员中没有血清学交叉反应。脂蛋白LppQ 的N 末端富含亲水氨基酸，表面暴露，在自然和试验感染牛体内特异性免疫反应产生早，持续时间长，抗体滴度高。更进一步的研究表明N 末端蛋白质在免疫斑点试验中能与MmmSC 感染后5个月的牛血清发生反应；相反，其C 末端富含疏水氨基酸，是一种膜内结构，不具有免疫原性。这些证据显示lppQ 基因N 末端是一种较为理想的CBPP 诊断抗原[6]。

lppQ 基因全长为1 335 bp，编码445个氨基酸，其中包含多个TGA 密码子。TGA 密码子在支原体中编码色氨酸（Trp ），而在其它微生物中则为终止密码子。lppQ 基因N 末端第66位是TGA 密码子编码的Trp （第196-198位碱基）。为了将中国MmmSC 分离株lppQ 基因N 端在大肠杆菌中表达，本研究采用快捷、高效的一步重叠延伸PCR 突变方法，将第66位的TGA 突变为TGG （编码Trp ），并将突变后的lppQ 基因N 端克隆到原核表达载体pET32a 的多克隆位点，构建了原核表达载体。重组表达的脂蛋白LppQ 在大肠杆菌中以可溶性形式存在，纯化后的脂蛋白LppQ 经Western blot检测具有良好的免疫活性。

将纯化后蛋白质稀释至0.35 μg·ml-1包被96孔酶标板，对ELISA 反应条件进行了优化。在ELISA 反应中使用鱼明胶代替脱脂乳和BSA 作为抗原结合位点封闭剂，取得了比较好的效果。应用TG-ROC 软件对48份阳性血清和98份假定阴性血清进行统计分析，确定待检样品OD 临界值为0.376。这种计算方法与常规的算术加权平均相比更加合理。按照国际通行标准，

一种诊断方法的敏感性试验样品数应为300个，特异性试验样品数应为1 000个。但这个样品数量，尤其是敏感性样品数量在中国是非常困难的。因为CBPP 在中国已接近于被消灭状态，很难找到自然感染的发病牛，本试验用人工感染MmmSC 的牛血清，在数量上还没有达到国际上通行的要求；用于特异性试验的假定样品数理论上可以达到1 000个，但应与敏感性试验样品数量保持相应比例，所以选择了163份样品。从以上结果可以看出，建立的ELISA 方法的敏感性和特异性令人满意。交叉反应性试验结果表明，LppQ

蛋白与口蹄疫、牛结核病和牛流行热阳性血清不存在交叉反应。国外学者[5] 也尝试了利用重组表达的脂蛋白LppQ 建立间接ELISA 方法来检测CBPP 血清抗体，并取得了令人满意的结果。但其表达的lppQ 基因需要进行多次突变才能在体外实现表达。本研究选取了中国生产抗原用菌株HVRI Ⅹ株N 末端一段基因，只需进行一次突变即可实现体外表达，而且表达蛋白质的特异性非常好。由于国外的间接ELISA 试剂没有商品化，因此无法将本研究建立的间接ELISA 方法与其进行直接比较。

应用国际标准CFT 和间接ELISA 方法对3个省、自治区送检的3 817头份牛血清进行了对比检测。从总体结果看，两种方法的血清学阳性率分别为0.3%（12/3817）和0.6%（26/3817），根据生物统计原理计算Kappa 值为0.63，说明两种方法有中高度一致性。CFT 检测的阳性样品用ELISA 检测全部为阳性，而ELISA 多检测出14份血清为阳性。这其中西藏自治区有10份血清为ELISA 阳性，CFT 阴性，而西藏自治区正是CBPP 历史流行的老疫区，而且处于中国边境线上，因此仅仅从血清学结果无法说明。而在云南省和贵州省，两种方法的结果非常令人满意。关于ELISA 方法检出率高于CFT ，笔者认为ELISA 检测的是针对MmmSC 的IgG 抗体，而CFT 检测的是IgM 抗体。由于IgG 比IgM 在体内出现晚并保持时间长，所以ELISA 方法阳性率高于CFT 。

中国从20世纪50年代开始在全国大面积使用弱毒疫苗免疫，成功控制了CBPP 在中国的流行。90年代以后则采取检疫、扑杀、隔离的措施力图消灭CBPP 。在1992年开始进行的全国性监测中，主要使用国产补体结合试验和微量凝集试验进行血清学检测并结合临床、病理和病原分离等技术手段。建立敏感、特异、快速的诊断技术对于进行流行病学调查和口岸

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[6] 39卷

隔离检疫是非常必须的。本研究在国内首次报道应用重组LppQ N端脂蛋白建立的ELISA 方法，通过对 Urs B, Jose R, El-Mostafa A, Otto J B. Huebschle , Joachim F. Serodiagnosis and monitoring of contagious bovine 3 817头份牛血清样品检测结果表明，该方法在血清流 行病学研究中具有良好的应用前景。

4 结论

利用一步重叠延伸PCR 突变方法，将中国MmmSC 分离株lppQ 基因N 端第66位的TGA 突变为TGG （编码Trp ），并构建了原核表达载体。优化了重组蛋白表达条件，以可溶性形式存在于宿主菌中。使用Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒进行纯化后的脂蛋白LppQ ，经Western blot检测具有良好的免疫活性。纯化后蛋白质稀释至0.35 μg·ml-1包被96孔酶标板，对来自3个省、自治区的3 817头份牛血清进行了检测，并与国际标准的CFT 进行了比较，Kappa 值为0.63，两种方法有中高度一致性。应用重组LppQ 蛋白建立的间接ELISA 方法具有良好的应用前景。

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(责任编辑 林鉴非)