纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制_谢小保

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　　材料工程/2008年10期　

纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制

S tudy of A ntimicrobial A ctivity and M echanism of Silver N anoparticles o n Escherichia coli

谢小保1, 2, 李文茹1, 2, 曾海燕1, 2, 欧阳友生1, 2, 陈仪本1, 2

(1广东省微生物研究所, 广州510070; 2广东省菌种保藏与应用重点实验室, 广州510070)

XIE Xiao -bao , LI Wen -ru ,

ZENG H ai -y an 1, 2, OU YANG You -sheng 1, 2, CH EN Yi -ben 1, 2

(1Guangdong Institute o f Microbio logy , Guang zhou 510070, China ; 2G uangdo ng Prov -incial Key Laboratory of M icro bial Culture Co llection and Application , Guang zhou 510070, China )

摘要:以大肠杆菌为研究对象, 对纳米银的抗菌效果进行了研究, 并对其抗菌机制做了初步探讨。纳米银对大肠杆菌的抑制生长曲线的结果表明, 20μg /m L 的纳米银能够完全抑制106cfu /m L 的大肠杆菌细胞生长, 纳米银使大肠杆菌的延滞期加长, 并且纳米银浓度越高, 延滞期越长。采用透射电镜观察了经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞形态变化过程, 结果显示纳米银粒子先在细胞壁上产生小的孔洞, 通过这些孔洞进入周质空间, 导致细胞膜成分渗漏和破坏细胞膜, 进而进入细胞内部。进入细胞内部的纳米银粒子使DN A 浓缩呈紧张态, 并与破损细菌的细胞质结合积聚, 最后引起胞内物质流失。另外, 纳米银对大肠杆菌总D NA 影响的分析表明, 随着纳米银浓度的增高, 大肠杆菌总DN A 样品降解的程度增大。

关键词:纳米银; 大肠杆菌; 抗菌作用

中图分类号:R318. 08　　文献标识码:A 　　文章编号:1001-4381(2008) 10-0106-04

1, 2

1, 2

A bstract :The antimicro bial effect of the nanosilve r o n Escherichia coli and the antimicrobial mecha -nism w as studied elementarily . Ex perimental results indicated that the silver nanoparticles of 20μg /mL could inhibit completely the grow th o f 106cfu /m L cells in liquid LB medium . The grow th curv es show ed that silve r nanoparticles pro long ed the lag phase of E . coli , and the higher o f the co ncentra -tion o f silver nanopar ticles , the longer of the lag phase o f E . coli . Transmission electron micro scopy

(T EM ) w as used to evaluate the cell m orpho logy of bo th the no rmal and the treated E . coli . The ob -servatio n w ith TEM sugg ested that silver nanopa rticles lead to the fo rmatio n of " pits " in cell w all of the bacteria , and silver nanoparticles could enter into pe riplasm through the pits and de stroyed the cell membrane . Then the silver nano particles could enter into the bacterial cell , w hich no t only condensed DNA , but also co mbined and coag ulated with the cy toplasm of damaged bacteria . Finally , silve r nano -particles resulted in the leakage of cy to plasmic component . M oreover , the analysis of agar g el electro -phoresis demo nstrated that silver nano particles co uld increase the decomposability of g enom e DNA . Key words :nanosilver ; Escherichia coli ; antimicrobial activity 　　随着抗生素、消毒剂和杀菌剂等化学药物的大量使用, 由耐药性引起的微生物变异种群越来越多, 由此引发的全球性微生物灾害事件频频发生。为了防止微生物灾害事件的发生, 研发和应用新型抗菌材料是一种行之有效的方法。无机抗菌材料具有安全性高, 耐热性和持久性良好, 且不易产生抗药性等优点, 自20世纪80年代以来获得了陆续的开发与应用[1, 2]。其中, 载银无机抗菌材料因其毒性低、抗菌活性高、抗菌谱广, 已成为目前应用最广泛的无机抗菌材料

[3, 4]

　　纳米银作为无机抗菌材料, 由于其原子排列表现为介于固体和分子之间的“介态”, 表现出量子效应、小

尺寸效应和极大的比表面积, 具有其他载银无机抗菌材料无法比拟的抗菌活性, 可以有效地杀灭细菌、真菌、支原体等致病微生物。但是, 在纳米银抗菌材料得以发展和应用的同时, 相关基础研究明显滞后, 纳米银对细菌的作用机理尚未认识清楚, 这将影响纳米银抗菌材料的进一步发展和更为广泛的应用。　　本工作以大肠杆菌(Escherichia coli ) 为模式菌,

[5, 6]

。

　纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制

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LB 肉汤培养基、纳米银溶液和大肠杆菌, 使纳米银浓度分别为0, 2. 5, 5, 10, 15μg /mL 和20μg /m L , 大肠杆菌浓度为106cfu /m L , 放入(37±2) ℃培养箱中恒温振荡培养。每隔一段时间取样, 用分光光度计(DU640, BECKMAN 公司) 测定OD 600, 以培养时间为横坐标, OD 600为纵坐标, 绘制生长曲线。1. 2. 3　纳米银对细菌细胞形态和结构的影响　　将10μg /m L 纳米银处理的大肠杆菌和未经处理的对照组大肠杆菌培养12h 进行切片, 用透射电镜(日本日历H -600) 观察处理组的细菌形态变化。1. 2. 4　纳米银对细菌总DNA 的影响　　经10, 20μg /m L 纳米银处理和未经处理的大肠杆菌在(37±1) ℃培养箱中恒温振荡培养12h 后取样, 提取总DNA [7], 然后进行琼脂糖DNA 凝胶电泳。

研究了纳米银对大肠杆菌的抗菌作用, 并对其抗菌机

制做了初步的探讨, 为纳米银抗菌材料的广泛应用奠定科学基础。

1　材料与方法

1. 1　实验材料

　　纳米银溶液, 浓度为1000μg /m L , 纳米银粒径≤15nm , 上海沪正纳米科技有限公司提供; 大肠杆菌(Escherichia coli ) A TCC8739购自美国菌种保藏中心, 由本实验室保存; M H (M uellerH into n ) 肉汤和琼脂培养基由本实验室配制。1. 2　实验方法

1. 2. 1　纳米银的抗菌琼脂培养实验

　　配制纳米银浓度分别为0, 2. 5, 5, 10, 15μg /mL 和20μg /mL 的M H 琼脂, 每个浓度各倒3个平皿, 待琼脂凝固, 用多点接种器吸取2μL 制备好的107cfu /mL 大肠杆菌稀释液接种到琼脂表面, 每点菌数约为10cfu /mL , 置于(37±2) ℃恒温培养48h , 观察结果。1. 2. 2　纳米银的抗菌肉汤培养实验　　将6个50mL 三角瓶中分别加入20m L 灭菌的

4

2　结果

2. 1　纳米银对大肠杆菌的抑菌效果

　　纳米银抗菌琼脂培养实验结果如表1所示, 从表

1可以看出纳米银对大肠杆菌的最低抑菌浓度为10μg /mL 。

表1　纳米银最低抑制浓度实验

T able 1　M inimum inhibito ry co ncentration of nano silv er

C on cen tration of nan osilver /(μg ·mL -1)

Grow th of E . coli

0Grow th

2. 5Grow th

5Grow th

10No grow th

15No grow th

20No grow th

　　由纳米银抗菌肉汤培养实验结果绘制了纳米银对大肠杆菌的抑制生长曲线, 如图1所示。从图1可以看出, 对照组(0μg /m L ) 以及2. 5, 5, 10, 15μg /m L 纳米

银处理组的大肠杆菌样品的生长都呈现典型的生长曲线, 包括生长延滞期、指数期、稳定期和衰亡期几个典型阶段。将处理组与对照组相比较, 可以看出纳米银能够延长大肠杆菌的延滞期, 纳米银浓度越高延滞期越长。由于OD 600测得的是活菌和死菌的总数, 所以衰亡期不明显。当纳米银浓度达到20μg /m L 时完全抑制大肠杆菌的生长, 液体培养至48h 后取样进行平皿培养48h , 没有长出菌落。2. 2　抗菌作用机制

　　采用透射电镜观察了经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞的形态变化过程, 结果如图2所示。2a , b 是培养12h 的对照组大肠杆菌细胞, 2c , d , e 和2f 是经纳米银处理12h 的大肠杆菌细胞的内部结构。从2a , b 可以看出, 对照组大肠杆菌细胞的电子密度一致, 是

图1　纳米银对大肠杆菌的抑制生长曲线Fig . 1　Grow th curves of E . coli in different

con cen trations of nanosilver

态特征。细胞中的电子明亮物质是DNA 分子, 它们随机分布在大肠杆菌细胞的核区。而处理组大肠杆菌细胞的内部构造出现很大的变化, 如图2c , d 所示, 细胞的中心有一个很明显的电子明亮区域, 区域的中心

有浓缩很紧密的物质, 呈线性状态, 明亮区域的周围也

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的细胞壁与细胞膜脱离, 使DN A 分子浓缩呈紧张态。大肠杆菌电子明亮区域周围的电子致密颗粒可能是纳米银粒子; 而在电子明亮区域内部却没有电子致密颗粒, 显然是电子明亮区域阻止了纳米银粒子的进入。

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图2f 是图2e 中的大肠杆菌细胞的局部放大电镜照

片, 这个细胞非常特殊, 细胞内布满了电子致密的颗粒, 而没有电子明亮的区域, 这是经纳米银处理的大肠杆菌细胞晚期的典型形态特征, 此时细胞没有

了

图2　透射电镜下大肠杆菌形态结构

(a ) 未经纳米银处理的大肠杆菌放大20000倍, 箭头所指为随机分布在细胞内的电子明亮物质; (b ) 未经纳米银处理的大肠杆菌放大40000倍, 箭头所指为随机分布在细胞内的电子明亮物质; (c ) 经纳米银处理的大肠杆菌放大15000倍, 箭头所指为电子明亮区域; (d ) 经纳米银处理的大肠杆菌放大40000倍, 箭头所指为在电子明亮区域浓缩呈线性的DNA ; (e ) 经纳米银处理的大肠杆菌晚期细胞放大40000倍, 箭头所指为破损的细胞壁; (f ) 经纳米银处理的大肠杆菌晚期细胞放大100000倍, 是细胞壁破损的细胞

Fig . 2　M orph ology and structure of E . coli cells under transmission electron microscope

(a ) normal E . coli cells , the electron lig ht materials (arrow ) distributed randomly in cells (20000) ; (b ) normal E . coli cells , the electron ligh t materials (arrow ) distributed randomly in cells (40000) ; (c ) E . co li cells treated by nanosilver , the electron light region (arrow ) in the center of cells (15000) ; (d ) E . coli cells treated by nanosilver , condensed form of DNA (arrow )

in the electron light region (40000) ; (e ) the terminal E . coli cells treated by nanosilver , dam aged cell w all (arrow )

(40000) ; (f ) the terminal E . coli cells treated by nan os ilver , the cell w all was damaged (100000)

明显的核区, 细胞壁已经破损。

　　图3为纳米银对大肠杆菌总DNA 的影响。可以看出, 对照组与两个处理组(经过浓度分别为10μg /mL 和20μg /m L 的纳米银处理) 的大肠杆菌培养12h 后的总DNA 呈现相同的条带, 但处理组的DNA 量减少。条带下方的明亮区域是降解的DNA 。与对照组相比, 处理组的DNA 样品有更大程度的降解, 且随着纳米银浓度的增高, 大肠杆菌总DNA 样品降解的程

度增大。

虽然文献报道认为[9, 10]是带负电荷的细菌细胞和带正电荷的纳米银粒子之间的静电相互作用引起的。但是, 纳米银与细菌接触后对细菌细胞的损害过程、以及对细菌总DNA 的影响等方面, 系统的研究报道较少。　　从本工作对经纳米银处理过的大肠杆菌细胞形态影响的电镜结果可以看出, 经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞形态变化过程是循序渐进的, 纳米银粒子先在细胞壁上产生小的孔洞, 通过这些孔洞进入周质空间, 导致细胞膜成分渗漏和破坏细胞膜, 进而进入细胞内部。进入细胞内部的纳米银粒子使DNA 浓缩呈紧张态, 并与破损细菌的细胞质结合积聚, 最后引起胞内物质流失。So ndi 等[8]通过扫描电镜也观察到纳米, 细

3　讨论

　纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制

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小的孔洞, 通过这些孔洞进入周质空间, 导致细胞膜成分渗漏和破坏细胞膜, 进而进入细胞内部。进入细胞内部的纳米银粒子使DNA 浓缩呈紧张态, 并与破损细菌的细胞质结合积聚, 最后引起胞内物质流失。　　(3) 纳米银使大肠杆菌DNA 不再随机分布在细胞的核区, 而是在核区浓缩呈紧张态, 且能够增加大肠杆菌总DNA 样品的降解程度, 故纳米银通过浓缩DNA 使之失去复制能力和引起DNA 降解可能是其抑制细菌生长繁殖的作用机制之一。

图3　纳米银对大肠杆菌总DNA 的影响

(a ) 对照组的大肠杆菌总DNA ; (b ) 10μg /mL 的纳米银处理的大肠杆菌总DNA ; (c ) 20μg /mL 的纳米银处理的大肠杆菌总DNA

Fig . 3　Effect of n anosilver on genome DNA of E . coli (a ) genome DNA of normal E . coli cells ; (b ) genome DNA of E . coli cells treated w ith 10μg /m L nanosilver ; (c ) genom e

DNA of E . coli treated w ith 20μg /m L nanosilver

2004, 35(1) :31-38.

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基金项目:广东省自然科学基金资助项目(A06104481) 收稿日期:2008-06-11; 修订日期:2008-08-24

作者简介:谢小保(1966—), 男, 硕士, 副研究员, 主要从事抗菌材料的抗菌作用机理及微生物耐药机理研究, 联系地址:广州市先烈中路100号大院广东省微生物研究所(510070) 。E -mail :xxiaob ao @tom . com

○

胞壁上有很多的孔洞, 并观察到纳米银粒子和死亡的细胞形成了聚集体; X 射线能谱(EDAX ) 分析也表明, 大肠杆菌细胞膜中有很多纳米银粒子

[8]

。Am ro 等

[12]

在研究大肠杆菌细胞渗透性的结构基础时, 也发现细

胞膜上出现孔洞是由于细胞膜成分的流失, 主要是脂多糖和膜蛋白。

　　此外, 本工作采用透射电镜观察的纳米银对大肠杆菌细胞形态影响的实验结果和采用琼脂糖凝胶电泳观察的纳米银对大肠杆菌总DNA 的影响实验结果都表明, 纳米银也可能通过作用于细胞DNA 而抑制大肠杆菌的生长。DN A 是细胞中最重要的基因信息, DNA 的任何损伤都会引起生物体的变异或死亡。DNA 分子在松弛状态下才能有效地进行复制, 呈紧张状态的DNA 分子失去复制的能力。因此, 纳米银粒子也可能通过浓缩DN A 使之失去复制能力和引起DNA 降解来抑制细菌的生长繁殖。本工作通过电镜观察到经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞, DNA 不再随机分布在细胞的核区, 而是在核区浓缩呈紧张态的现象, 还有研究工作者有同样的发现。Feng 等[11]在研究硝酸银对大肠杆菌的抑菌作用时, 发现经硝酸银处理过的大肠杆菌细胞与本工作用纳米银处理过的大肠杆菌细胞具有同样的特征:细胞中心有一个电子明亮的区域, 其中心是浓缩的DN A 分子。

4　结论

　　(1) 纳米银使大肠杆菌的生长延滞期加长, 并且纳米银浓度越高, 生长延滞期越长。　　(2) 经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞形态变