人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良

上海口腔医学２００７年６月第１６卷第３期

ＳｈａｎｇｈａｉＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙＶｏｌ．１６Ｎｏ．３Ｊｕｎｅ，２００７

・・２６３

［文章编号］１００６－７２４８（２００７）０３－０２６３－０５

人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良

李树波１，李德懿１，葛锡锐２

（１．上海交通大学医学院附属第九人民医院，

上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海２０００１１；

２．中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，上海２０００３２）

方法：取正畸拔除的牙周组织健［摘要］目的：改良人结合上皮（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＪＥ）细胞的分离培养及冻存方法。

剪碎ＪＥ组织，简化培养操作康的前磨牙，沿龈缘剪去冠方１ｍｍ左右的沟内上皮，用无菌１１号刀片紧贴牙面刮下、

步骤。取第２代ＪＥ细胞，加入冻存液，按设定的降温程序（从０℃开始，以每分钟下降１．５℃速度下降至－１８℃，保持

５ｍｉｎ；再以每分钟下降２０℃的速度降至－８０℃，然后投入－１９６℃液氮罐）冻存细胞，４０℃水浴复苏，进一步研究ＪＥ细胞

的形态、增殖、鉴定及复苏后存活率等生物学活性。结果：不用Ｄｉｓｐａｓｅ冷消化，采用０．１％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化，同样可成功地培养人ＪＥ细胞；ＪＥ细胞复苏后的存活率为（９３．８７±３．１１）％，生长状况良好，与第２代细胞相似；免疫细胞化学染色显示，培养的ＪＥ细胞角蛋白－１９（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－１９，ＣＫ１９）表达强阳性，而波形丝蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）表达也为阳性。结论：改良的ＪＥ分离培养与冻存方法可行，ＪＥ表型在体内和体外并非完全一致，可能与细胞生长的底物有关。

［关键词］结合上皮；细胞培养；细胞冻存；免疫细胞化学［中图分类号］Ｒ７８０．２

［文献标识码］Ａ

ＴｈｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｈｕｍａｎｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｃｅｌｌｓＬＩＳｈｕ－ｂｏ１，ＬＩｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＤｅ－ｙｉ１，ＧＥＸｉ－ｒｕｉ２．（１．ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＮｉｎｔｈＰｅｏｐｌｅ’

ＪｉａｏＴｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＳｈａｎｇｈａｉＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００１１；２．ＣｅｌｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ．Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００３２，Ｃｈｉｎａ）

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＰＵＲＰＯＳＥ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇ，ｃｕｌｔｕｒｉｎｇａｎｄｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（ＪＥ）ｃｅｌｌｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ：

ＪＥｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｙｈｅａｌｔｈｙｐｒｅｍｏｌａｒｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｏｒ

ｏｒｔｈｏｄｏｎｔｉｃｒｅａｓｏｎｓ．Ｔｈｅｓｕｌｃｕｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｗａｓｒｅｍｏｖｅｄａｔａｄｉｓｔａｎｃｅｏｆ１ｍｍｆｒｏｍｔｈｅｇｉｎｇｉｖａｌｍａｒｇｉｎ．ＪＥｔｉｓｓｕｅｗａｓｄｅｔａｃｈｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｔｅｅｔｈｂｙｕｓｉｎｇ１１＃ｓｔｅｒｉｌｅｂｌａｄｅａｎｄｍｉｎｃｅｄｉｎｔｏｓｍａｌｌｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄＪＥｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈａｆｒｅｅｚｉｎｇｍｅｄｉｕｍｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ９０％ｃａｌｆｓｅｒｕｍａｎｄ１０％ＤＭＳＯ．Ｔｈｅｆｒｅｅｚｉｎｇｐｒｏｔｏｃｏｌｗａｓａｐｐｌｉｅｄｕｓｉｎｇａｃｏｍｐｕｔｅｒ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｆｒｅｅｚｅｒｔｏｆｒｅｅｚｅｔｈｅｍｅｄｉｕｍｔｏ－８０℃ｂｅｆｏｒｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｌｕｎｇｅｄｉｎｔｏｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｓｔｏｒｅｄ．Ｔｈｅａｂｏｖｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｏｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＪＥｃｅｌｌｓａｎｄｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙａｆｔｅｒｔｈａｗｉｎｇ．ＲＥＳＵＬＴＳ：０．１％ｔｒｙｐｓｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．０２％ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ（ＥＤＴＡ）ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｓｏｌａｔｅＪＥｃｅｌｌｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｗｉｔｈｏｕｔｄｉｓｐａｓｅ．

ＴｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈａｗｉｎｇＪＥｃｅｌｌｓｗａｓ（９３．８７±３．１１）％，

ａｎｄｔｈｅ

ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｓｓａｇｅＪＥｃｅｌｌｓ．ｉｓｎｏｔａｌｗａｙｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｖｉｖｏ．ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｌｅｖｅｒ．

［收稿日期］２００７－１－１２；［修回日期］２００７－０３－２０

［基金项目］国家自然科学基金（３０６７２３１４）；上海－联合利华研究与发展基金［作者简介］李树波（１９７８－），男，博士研究生

［通讯作者］李德懿，Ｔｅｌ：０２１－６３１３５４１２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｒｉｓ＠ｓｈ１６３．ｎｅｔ

上海口腔医学》编辑部所有ｃ２００７年版权归《

ＣＫ１９ａｎｄｖｉｍｅｎｔｉｎｗｅｒｅｂｏｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎＪＥｃｅｌｌｓ

ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｃｏｕｌｄｂｅａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｏｐｒａｃｔｉｃｅ．ＴｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＪＥｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ

Ｉｔｍｉｇｈｔｂｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｗｈｉｃｈｃｅｌｌｓｇｒｏｗｉｎｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈ．

（ＧｒａｎｔＮｏ．３０６７２３１４）

ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ

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李树波，等．人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良

ＬＩＳｈｕ－ｂｏ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｈｕｍａｎｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｃｅｌｌｓ

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＳｈａｎｇｈａｉＪＳｔｏｍａｔｏｌ，２００７，１６（３）：２６３－２６７．

结合上皮（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＪＥ）是牙龈组织附着在牙表面的一条带状上皮，是无角化、低分化的特殊组织。ＪＥ持续受到病原微生物的侵袭，或者作为靶细胞产生多种酶，如明胶酶、弹性蛋白酶及透明质酸酶等，它们破坏内侧基底板，使ＪＥ与牙面分离，上皮附着丧失，最终引发牙周炎的一系列临床症状。可见ＪＥ是牙周炎发生的始发部位，也是牙周病学界研究的热点［１］。Ｇａｏ及Ｔａｋａｓｈｉ等［２，３］先后将人ＪＥ组织块接种于３Ｔ３成纤维细胞滋养层或包被有可溶性基底膜成分的培养皿上，成功地培养出ＪＥ。但成纤维细胞的存在并不利于细胞代谢水平的检测。目前国内ＪＥ的研究刚刚起步，本实验组前阶段采用

学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科选择因正畸拔除的牙周健康的前磨牙，用１１号刀片自龈沟底切向牙槽嵴顶（沟内切口），分离牙龈，拔出后迅速放入含青链霉素双抗的Ｄ－Ｈａｎｋｓ液中。用眼科剪沿龈缘剪去冠方约１ｍｍ左右的沟内上皮，然后用无菌

１１号刀片紧贴牙面刮下ＪＥ组织，剪碎成２ｍｍ３左右

的组织块，Ｄ－Ｈａｎｋｓ反复漂洗，不用Ｄｉｓｐａｓｅ冷消化，直接加０．１％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡ，３７℃震荡消化１５ｍｉｎ，８０目不锈钢滤器过滤，加无血清角质细胞培养液，制成２×１０４个／ｍｌ的细胞悬液，３７℃、５％

ＣＯ２培养箱培养。１．２．２

ＪＥ细胞的形态、增殖和免疫细胞化学特征

倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，取生长旺盛的第２代细胞，制成细胞悬液，以１×１０４个／孔密度接种于２４孔板，每天计数３孔细胞数，取其均值。以细胞数和培养天数绘制生长曲线，计算倍增时间。常规检测细胞角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）和波形丝蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）的表达。

Ｄｉｓｐａｓｅ冷消化结合胰蛋白酶－ＥＤＴＡ消化法，在国内首次成功分离培养出人ＪＥ细胞［４］，但培养步骤繁杂，

成功率低，且细胞冻存复苏后大多死亡，因此改良和优化ＪＥ的体外培养与保存条件势在必行。本研究对

ＪＥ的分离培养及冻存方法进行了改进，现报道如下。１１．１

材料与方法材料

无血清角质细胞培养液（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ），０．１％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ），胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｄ－Ｈａｎｋｓ缓冲液（自配，内含

１．２．３ＪＥ细胞的冻存与复苏备冻细胞的预处理：

生长良好的第２代ＪＥ细胞收集于离心管中，离心去上清后，加入１ｍｌ冻存液（二甲基亚砜与胎牛血清的比例为１∶９），用吸管反复吹打，使细胞均匀，最终浓度为２．０×１０６个细胞／ｍｌ，然后转移至无菌塑料冻存管内。

冻存细胞的处理：设定降温程序，从０℃开始，以每分钟下降１．５℃速度下降至－１８℃后，保持５ｍｉｎ；再以每分钟下降２０℃的速度降至－８０℃。将冻存管置入安装有程控降温速率仪的冷冻箱内，按设定的降温程序降低箱内的温度。当温度降至－８０℃（即液氮口）时，放置１ｄ后打开冷冻箱，将包有冻存管的布袋迅速投入液氮（－１９６℃）中。

冻存细胞的复苏：冻存管从液氮罐中取出，快速放入预热至４０℃的温水浴中，并不时振动使其尽快融化。将细胞用吸管吸出，转入离心管中，一部分采用Ｃａｓｙ细胞分析仪计算存活率，另一部分制成细胞悬液，接种于培养皿中，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况，上述实验重复３次。

４００Ｕ／ｍｌ青霉素，４００μｇ／ｍｌ链霉素），二甲基亚砜

（ＤＭＳＯ，Ａｍｅｒｓｃｏ产品）。鼠抗人ＣＫ１９（Ａ５３／ＢＡ２）和波形丝蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）单克隆抗体（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ），二

抗试剂盒（生物素标记羊抗鼠ＩｇＧ，辣根酶标记链霉

ＵＳＡ），３％过氧化氢液，０．０１％

Ｔｒｉｔｏｎ－１００和１０％中性甲醛溶液（自配），ＤＡＢ显色液（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ），ＰＢＳ缓冲液（自配）。

百级层流室，３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度细胞培养箱（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ），一次性塑料培养皿／板（Ｏｒａｎｇｅ，ＵＳＡ），离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ），倒置相差显微镜（Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ａｘｉｏｓｈｏｐ２Ｐｌｕｓ摄影显微镜（ＺＥＩＳＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｃａｓｙ细胞计数仪（ＳＣＨ$ＲＦＥ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＷＫＬ－９８微机控制速率冷冻仪（北京四环

科学仪器厂生产）。

卵白素，ＺＹＭＥＤ，

１．２１．２．１

实验方法

分离和培养ＪＥ细胞的取材、

在上海交通大

２２．１

结果

ＪＥ细胞的一般生物学特性

上海口腔医学２００７年６月第１６卷第３期

ＳｈａｎｇｈａｉＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙＶｏｌ．１６Ｎｏ．３Ｊｕｎｅ，２００７

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不用Ｄｉｓｐａｓｅ冷消化，能成功地分离培养人ＪＥ细胞，其形态、生长规律和以往报道［４］一致。原代ＪＥ细胞形态多样，为扁平形、梭形和卵圆形（图１Ａ）。第

１代细胞２４～４８ｈ后贴壁伸展，细胞克隆融合成片，

大小不一，排列紊乱。第２代细胞生长旺盛，形态良好，与原代相似（图１Ｂ）。从第３代起，细胞体积变大，出现“巨细胞”（图１Ｃ），且随传代次数增加，细胞形态更加不规则，增殖缓慢，最终第５代细胞衰老死亡（图１Ｄ）。根据生长曲线（图２），采用公式计算出

Ａ

ＪＥ的倍增时间为４０．３ｈ。

Ｂ

第２代ＪＥ细胞免疫细胞化学染色。Ａ．ＣＫ１９染色为强阳性，

Ｂ．Ｖｉｍｅｎｔｉｎ染色为阳性（×１００）图３．

Ｆｉｇｕｒｅ３．ＴｈｅｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄＪＥｃｅｌｌｓ．Ａ．ＣＫ１９ｗａｓｓｔｒｏｎｇｌｙｓｔａｉｎｅｄｉｎＪＥｃｅｌｌｓ，Ｂ．Ｖｉｍｅｎｔｉｎｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅ（×１００）

图１．培养的人ＪＥ细胞。Ａ．原代，Ｂ．第２代，Ｃ．第３代，Ｄ．第５

代（×１００）

Ｆｉｇｕｒｅ１．ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎＪＥｃｅｌｌｓ．Ａ．Ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂ．Ｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｓｓａｇｅ，Ｃ．Ｔｈｅｔｈｉｒｄｐａｓｓａｇｅ，Ｄ．Ｔｈｅｆｉｆｔｈｐａｓｓａｇｅ（×１００）

１２００００细胞数（个／ｍｌ）

１０００００８００００６００００２００００

０

１

２

３

４

５

６

７

８

培养时间（ｄ）

图４．

１００）

复苏后的ＪＥ细胞形态无明显变化，与第２代细胞相似

（×

Ｆｉｇｕｒｅ４．ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈａｗｉｎｇＪＥｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｓｓａｇｅＪＥｃｅｌｌｓ（×１００）

图２．第２代ＪＥ细胞的生长曲线

Ｆｉｇｕｒｅ２．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｓｓａｇｅＪＥｃｅｌｌｓ

２．２ＪＥ细胞的免疫细胞化学染色

ＪＥ细胞ＣＫ１９染色为强阳性，ｖｉｍｅｎｔｉｎ染色为

阳性（图３）。２．３

ＪＥ冻存细胞的复苏与形态观察

复苏后的ＪＥ细胞生长良好，呈多角形，大小不一，轮廓清晰（图４），与第２代细胞相似（图１Ｂ）。细胞存活率为（９３．８７±３．１１）％（图５）。

ＪＥ细胞复苏后的存活率。Ａ．细胞碎屑，Ｂ．死细胞，Ｃ．活细胞

Ｆｉｇｕｒｅ５．ＴｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈａｗｉｎｇＪＥｃｅｌｌｓ．Ａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｂｒｉｓ，Ｂ．Ｄｅａｄｃｅｌｌｓ，Ｃ．Ｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ

图５．

・・２６６

李树波，等．人结合上皮细胞体外培养与冻存方法的改良

ＬＩＳｈｕ－ｂｏ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｈｕｍａｎｊｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｃｅｌｌｓ

３讨论

ＪＥ位于沟内上皮的根方，呈领圈状附着于牙冠

或牙根表面。ＪＥ的长度约０．２５～１．３５ｍｍ，仅１０～２０细胞层厚，因此培养能否成功，取材是关键。Ｔａｋａｓｈｉ等［３］于颊侧距龈缘１～２ｍｍ处作内斜切口和沟内切口，拔除健康牙，用眼科剪剪去牙龈上皮及其下方的结缔组织，以便获取ＪＥ。一方面该法需作手术及患者的密切配合，另一方面在修剪过多组织时，不易把握操作的精确度。本实验利用因正畸而拔除的健康牙，直接采用沟内切口分离牙龈，简化了上述取材步骤。此外，对ＪＥ组织的处理方法与以前不同，并未浸入

形成，对细胞膜具有保护作用。另外，使用程序控制冷冻仪，慢冻快融，可以最大限度地保存细胞活性。传统检测细胞活力的方法多采用台盼蓝染色，其只适用于检测坏死细胞，但如细胞发生凋亡，仍有排除染料的能力，且随时间点不同，计数差异亦较大，故台盼蓝不能作为鉴定细胞精确死亡的标准靠，为培养工作提供了极大方便。

关于细胞来源的鉴定，一般来说外胚层来源的上皮细胞，细胞角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）的表达呈阳性反应、波形丝蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）呈阴性反应，而中胚层来源的间充质细胞则相反。有研究发现，ＣＫ１９可作为ＪＥ的特征性标志物［８］，本实验证实体外培养的

［７］

。Ｃａｓｙ

细胞计数仪可以弥补上述缺点，其数据结果准确、可

Ｄｉｓｐａｓｅ溶液中，而是直接采用胰蛋白酶消化分离。Ｄｉｓｐａｓｅ是一种分离上皮与真皮的中性蛋白酶，在分

离上皮时，作用于基底膜，选择性地分解纤维连接素和Ⅳ型胶原，而保存上皮细胞的活性和连接，在口腔医学研究中，已被广泛用于培养牙龈上皮细胞而ＪＥ是龈牙结合部的特（ｇｉｎｇｉｖａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＧＥ）［５］。

殊组织，通过内侧基底板和外侧基底板分别与牙面和牙龈结缔组织相连接［２］。Ｏｋｓａｎｅｎ等［６］比较了鼠ＪＥ与ＧＥ的基底板组成，发现ＪＥ的外侧基底板与ＧＥ不同，且ＪＥ的内侧基底板只含有层黏连蛋白－５，可见ＪＥ的内侧基底板并非真正意义上的“基底膜”，因此分离ＪＥＤｉｓｐａｓｅ是否必要还受到质疑。

胰蛋白酶消化法是较为常用的分离组织方法。消化时间、组织块大小该法受其浓度、温度、ｐＨ值、的影响，浓度过大、消化时间过长，细胞都会被消化掉。但当选择合适的参数时，胰蛋白酶经济、适应范围广和可操作性强又是其他酶所不可比拟的。经过反复摸索，发现０．１％胰酶浓度较为有效。ＪＥ细胞原代培养时可能存在成纤维细胞污染，无血清培养液及其中的低浓度钙离子（＜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）可以抑制成纤维细胞生长。倒置相差显微镜下观察证实，ＪＥ细胞的生长规律与以往报道一致。

由于ＪＥ细胞体外培养难度较大，生命周期短，衰老较快，因此对其进行低温保藏无疑是保存的理想方法。但降温速度的快慢与细胞的冻存效果有直接关系：降温速度太快，影响细胞内水分透出，而太慢则促进冰晶形成。以前将装有备冻细胞的冻存管直接放入液氮口，１天后投入到液氮罐中，结果细胞复苏后大多死亡。本实验采用含１０％ＤＭＳＯ的冻存液，效果较好。ＤＭＳＯ可以加快结晶过程，减少冰晶

ＪＥ细胞ＣＫ１９表达为强阳性，而ｖｉｍｅｎｔｉｎ也为阳性。Ａｌｔｍａｎ等［９］以３Ｔ３成纤维细胞作为滋养层，包被有

可溶性基底膜成分的培养皿培养大鼠ＪＥ细胞，发现ＣＫ１９表达为阳性，而ｖｉｍｅｎｔｉｎ为阴性，符合外胚层

来源的细胞特性。但Ｂａｍｐｔｏｎ等［１０］将培养的人ＪＥ和

ＧＥ细胞与ＪＥ和ＧＥ组织进行ＣＫ１９和ｖｉｍｅｎｔｉｎ染

色，发现ＣＫ１９体内与体外表达无区别，ｖｉｍｅｎｔｉｎ在体外培养的ＪＥ和ＧＥ细胞为阳性，而在组织切片中表达为阴性，提示ＪＥ和ＧＥ细胞表型在体内与体外目前主要并非完全一致，可能与其生长的底物有关。有２种假设可以解释这一现象：⑴上皮下结缔组织对复层鳞状上皮的表型有诱导作用，影响上皮的结构与功能。在口腔中，由于ＪＥ受牙周韧带的影响，

ＧＥ受固有层的影响，它们之间在时间和空间上的详

细作用机制还有待进一步研究。⑵ＪＥ解剖部位特殊，通过内侧基底板与牙面相互附着。有学者利用可溶性基底膜培养ＪＥ细胞，该基底膜主要包括层黏连蛋白、纤维黏连蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质成分，它们与ＪＥ细胞通过“上皮附着装置”而相互连接，且在两者之间传递分子信息，可能最终对ＪＥ细胞的基因表达和分化具有调控作用［１１］。

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［９］

出版发行《头颈部血管瘤与脉管畸形》

由张志愿、赵怡芳教授主编，郑家伟、秦中平教授副主编的我国第一部有关血管瘤和脉管畸形的专著—头颈部血管瘤与脉管畸形》——《（ＩＳ－・ＢＮ：９７８－７－５０６２－７４７１－５／Ｒ１１１）作为口腔医学精粹丛书之一，于２００７年５月由世界图书出版（上海）公司出版发行。该书的出版发行，填补了我国在该领域的空白。

脉管性疾病（ｖａｓｃｕｌａｒａｎｏｍａｌｉｅｓ）是婴幼儿期最常见的良性肿瘤或发育畸形，文献报道，血管瘤在新生儿的发病率为１．１％～２．６％，１岁时的发其中，３５％～虽然脉管性疾病属于良性病变，但发生在颌面颈部的病变，不仅导致严重的容貌毁损，还可能因病率高达１０％。６０％发生在头颈部。为阻塞呼吸、消化道而影响发音、进食，甚至导致出血、窒息并危及生命。２０世纪８０年代以前，国内外对于脉管性疾病的分类、诊断比较混乱，笼统称为血管瘤，以至于在治疗上常因“治疗过度”而带来许多后遗症或“治疗不足”而贻误时机。

１９８２年，哈佛大学医学院儿童医学中心整形外科的Ｍｕｌｌｉｋｅｎ和Ｇｌｏｗａｃｋｉ教授，根据多年的临床与基础研究，率先提出了脉管性疾病的生物学分类方法（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ），澄清了长期以来对两类疾病的模糊认识，明确提出将脉管性疾病分为血管瘤和脉管畸形，前者是具有血管内皮细胞异常增生的肿瘤或类肿瘤性疾病，后者则是无内皮细胞异常增生的非肿瘤性先天性发育畸形，两者的生物学行为和自然病史有着本质的差异，因此治疗方法完全不同。

Ｍｕｌｌｉｋｅｎ和Ｇｌｏｗａｃｋｉ的生物学分类，在脉管性疾病的治疗和研究史上具有里程碑式的意义，得到了世界各国学者的广泛认同。１９８８年，血管胎记：血管瘤和畸形》一书，根据新的分类，对血管瘤、脉管畸形的诊断和治疗，进行了详细的、全新的论述。Ｍｕｌｌｉｋｅｎ和Ｙｏｕｎｇ合作出版了《

１９７６年，Ｍｕｌｌｉｋｅｎ和Ｙｏｕｎｇ在Ｂｏｓｔｏｎ发起成立国际脉管性疾病专题研究组（Ｗｏｒｋｓｈｏｐ），由于是一个新兴的领域，且横跨几个学科，因此最初只是邀请几个专业的学者进行开放式讨论。其后，与会者逐渐增多，每２年在欧洲或美国的城市举行１次会议。１９９２年，在Ｂｕｄａｐｅｓｔ，决定将该组织正式命名为国际脉管性疾病研究学会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＳｔｕｄｙｏｆＶａｓｃｕｌａｒＡｎｏｍａｌｉｅｓ，简称ＩＳＳＶＡ）。经过２年的传真联系和讨论，１９９６年６月，脉管性疾病的ＩＳＳＶＡ分类被参加罗马会议的成员接受。

在Ｍｕｌｌｉｋｅｎ和Ｇｌｏｗａｃｋｉ分类和ＩＳＳＶＡ分类的基础上，学者们根据最新的研究成果，不断提出修改和补充意见。１９９３年，Ｊａｃｋｓｏｎ等根据影动静脉畸形）和低流量畸形（ｌｏｗ－ｆｌｏｗｍａｌｆｏｒ－像学资料和血液流体力学原理，将脉管畸形分为高流量畸形（ｈｉｇｈ－ｆｌｏｗｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）（动脉畸形、

淋巴管畸形）２类，并提出了相应的治疗方案，迄今仍有临床指导意义。１９９９年，Ａｒｋａｎｓａｓ儿童医院脉管性疾病中心主任ｍａｔｉｏｎｓ）（静脉畸形、

Ｗａｎｅｒ教授和Ａｒｋａｎｓａｓ医科大学耳鼻咽喉－头颈外科主任Ｓｕｅｎ教授在前人工作的基础上，正式提出将毛细血管畸形（ｃａｐｉｌｌａｒｙｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）命头颈名为微静脉畸形（ｖｅｎｕｌａｒｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ），认为动静脉畸形是真正的毛细血管畸形，将淋巴管畸形分为大囊型和微囊型２类，并合作出版了《部血管瘤和脉管畸形》一书。

虽然ＩＳＳＶＡ分类和Ｗａｎｅｒ－Ｓｕｅｎ分类仍有不完善之处，但自其公布之后，国际会议及国际学术期刊使用的分类术语逐渐趋于统一，但在我国，由于血管瘤和脉管畸形属于跨学科就诊疾病，名称混用、治疗混乱的现象仍然存在。有鉴于此，２００２年７月，中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会在山东省临沂市召开了首届全国口腔颌面部脉管性疾病研讨会，得到了有关同行的积极响应。会议取得了一定成果，提出了采用

Ｗａｎｅｒ－Ｓｕｅｎ分类及治疗方法选择的初步意见。２００２年１１月，在昆明召开的第三届中国国际口腔颌面外科学术会议及第六届全国口腔颌面外科学术会议上，专门举行了口腔颌面部血管瘤及脉管畸形分组研讨会，与会同行踊跃发言，积极参与讨论。２００４年４月２７日，经中华口腔医学会第二届第九次常务理事会审议，批准成立脉管性疾病学组（ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＶａｓｃｕｌａｒＡｎｏｍａｌｉｅｓ），邱蔚六院士代表口腔颌面外科专业委员会宣布学组成立，并公布第一届学组成员名单。学组的主要任务是组织口腔颌面部脉管性疾病的学术交流和科研活动，推广新分类，规范临床诊断和治疗行为，减少医疗差错和纠纷。

我国幅员辽阔，人口众多，各地区医疗水平参差不齐，差距甚大，推广和普及脉管性疾病新分类、规范治疗的任务相当艰巨。为了给从事脉在口腔颌面部血管瘤和管性疾病治疗和研究的医护、科研人员和广大患者提供参考资料，张志愿教授等组织国内１４位具有博士和硕士学位、脉管畸形诊治与研究方面具有丰富经验的有关专家，根据自己的临床经验，结合国内外最新研究成果，经过１年多的努力，编写完成这部《头颈部血管瘤和脉管畸形》。

诊断、治疗和基本书共１３章，３０万字，按照Ｗａｎｅｒ和Ｓｕｅｎ的最新分类，配合２００余幅彩色插图，对口腔颌面部血管瘤和脉管畸形从分类、

础研究等方面，进行了详尽论述。可供口腔颌面外科、耳鼻咽喉－头颈外科、整形外科、皮肤科、激光科、小儿外科等专业的中高级临床医师、护理人员、科研人员和研究生、进修医师等参考，也可供广大患者及家长阅读。

本书为铜版纸彩色印刷，１６开本，精装，１７９页，每本定价１６０元，各地新华书店有售。欲购者，也可直接与出版社发行部联系购买事宜。