以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题
,
・
・
综述
・
以 加 权 最 小 二 乘 法 建 立生 物 分 析 标 准 曲 线 的 若 干 问题
钟 大放
沈 阳 药 科大 学 药 物 分 析 研 究 室 沈阳
根 据 国 际 上 有关 生 物 分析方法 确证 的指 导 原
则
,
规范提 出
,
应采 用 质量 控制
、
样 品 评 价分
。
要 求 对 不 同 浓 度 生 物 样 品 测 量 结果 的相对误 差
析 方 法 的准 确 性
精 密 度 及 测 试 结 果 的有 效 性
、
不得超过
,
或
。
由 于 生 物分 析 所 测 定 的浓 度
,
。
样 品取
个 浓 度 分 别 在 最 低 最 高检 测 限 附近 和 待
,
。
范 围 宽 若 采 用 普通 最 小 二 乘 法 建 立 标准 曲线 在 低
浓 度 区域很难满足 上述要求
测 浓 度 范 围 中部
在 分 析 方 法 建 立 阶段 和 未 知 样 品 样 品 的测 量值相 对 误差分
或士
,
本文 通 过 总 结 作 者 多
讨论 了 以 加 权 最 小二
、
分 析 阶段
,
一般要求
年 从 事生 物 分 析 工 作 的经 验
。
,
别在理论值 的 士
范围内
。
乘 法 建 立 标 准 曲线 的 优 越 性 介 绍 了 该 法 的原 理 计
算公式及应用实例 研究中
,
,
需 要 特 别 指 出 的是 这 里 规 定 的 是 相 对 误 差 限 由于 生 物 分 析 所 测 定 的浓 度 范 围 宽
,
。
故在 不 同浓 度
。
在进行 生物 利用 度
、
生 物 等效性 及 药物 动力学
区域测 量值 的相对误差 与绝对误 差 远远 不 成 比例
要 对 生 物 徉 品 中的药 物 及其代谢 产物 进 行
,
一
例 如 在样 品浓度 为
,
时 测 量值绝 对 误 差
,
,
定 量分析
般 采 用 标准 曲线法 进 行 数 据 处 理 通过
,
。
仅使 其相 对误 差 达 到 时 误差高达
,
。
而在样 品浓 度为
对 系列 浓 度 的 标准 生 物样 品进行测定
得到 浓度
,
同样 大 的测 量 值绝 对 误 差 则 使其相 对
与响应
程
。
的对 应 数据
,
再 进行 回 归运算 得
,
这 提 示 我 们对 低 浓 度 区 域 的
。
样
到 标准 曲 线 方 程 在 色 谱 分 析 方 法 中 通 常 是 线 性 方 然 而 生 物 样 品 具 有 分 析 物 含 量 变 化 大 的特 点
, ,
品 的测 量 结果 应 给予 特殊 的关 注
除 了 实验 方 法 本
,
身之外
,
因 为不 同的 回 归 运算方 法对各 浓 度 点相 对
,
需 检 测 的浓 度 范 围宽
,
若使 用 了不恰 当 的 回 归运算
,
,
误差 的影 响也很大
。
所 以 能 否选 用 恰 当 的计算方法
,
方 法 会 得 不 到 最 佳 的 标 准 曲线 甚 至 导 致 错 误 的 计
以 获 得 最 佳 的 标 准 曲线
常常 会 决 定 生 物 分析 结果
算 结 果 为 解 决 这 一 问 题 本 文 讨 论 加 权 最 小二 乘 法
在 建 立 生 物 分 析 方 法 标 准 曲线
用
。
。
的质量
线性 方 程
中的应 性
通常 用于 建 立标准
曲线 的几种 回 归 方法 的局 限
生物 分 析方 法确证 的 有关 国际规范
由于 生 物 分 析 方 法 在 评 价 与 解 释 生 物 利 用 度
生 物 等 效性 及 药 物 动 力学 数 据 中的重 要 作 用 法 的确 证
,
,
、
普 通 最 小二 乘法 普通 最 小二 乘 法川 可 求算
归 直线 方 程 参数 截 距
,
一
。
形式的 回 由于 许 多 类 型 的
对方 年
,
和 斜率
已 引起 广 泛 关 注 仁 一
’
。
计 算器 上 有 此 功 能 键 故 应 用 较 广 对 于 色 谱 分 析 方
法
,
。
月 几 十 个 国 家 的 专 家 学 者 在 美 国 举 行 专 门会 议
一 般 为分 析 物 与 内标 物 的峰高
。
或 峰面积
‘
比
讨论制 定 了进行 生 物 利 用 度
力学研究时
,
、
生 物 等效 性 及 药 物 动
,
值
,
为 样 品 中分 析 物 浓 度 这 种 回 归 运 算 的 目 标 是 对 回 归 直 线上 对 应 估 计 量
,
‘ 生物 分析 方法 确证 的指 导 原 则 卜 〕
,
并
使得观 测值
差 的平 方 和 最 小
,
’
偏
在
种 国 际 性 学 术 期 刊发 表
“
成 为 目前 公 认 的 规 范
,
即达 到
艺
一
。
,
’ ’
。
对于 生
以下简称
规范
。
”
。
在规 范 中
,
要 求标准 曲线要 覆
一
物 分析 方法 来说
这 意 味着 标准 曲 线上 每 个 浓 度 点 然而经验和 理论都
盖未 知 样 品 的整 个浓 度范 围
应用
个浓 度 点确
的绝对 误 差 具有 同等 的重 要 性
定
不 含零点
刀
,
在本文 中
,
以 简 化 的 算 符 乏 代表
艺
之 二二二
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・
・
药物分 析杂 志
表明
,
生 物 样 品 测 试 的绝 对 误 差 会 随 浓 度 的增 加而
药 物 的浓度
。
表
、
列 举 了一 个典 型 的分 析批
增 加 在 需 检 测 的浓 度 范 围 最 高 检 测 限 与最 低检 测
,
标 准 曲 线与
,
样 品 的分 析 结 果 从 结 果 的 相
,
。
。
限 浓 度 之 比 为几 十 倍 甚 至 几 百 倍 时 使 用 普通 最 小
,
对 误 差 容 易 看 出 简单 地 使 用 未 加 权 的 最 小 二 乘 法
二乘法进行 回归运 算
的要求
。
,
获 得 的 标 准 曲线 必 然 导 致 在
,
将导 致 低 浓 度 区 域分 析 结果 的 准确 性 明显 下 降
,
,
这
低 浓 度 区 域 测 量 值 的相 对 误 差 甚 大 我 们 曾采 用 表
很难满足规范
一 事 实表 明 为 了满 足 规 范 的 各 项 要 求 保 证 分 析 结
果 的质 量 方 法 测 定 兔 血 浆 样 品 中的某 标准 曲线
回 归方程
,
,
必 须采 用 其他 回 归方法建立 生物分析标
准 曲线
。
根据
个样品 的 浓 度 与 响应数 据
,
,
分别 以
种方 法 求算线性
再将各样 品数据 回 代人这些方程
普通 最 小二 乘法 结
果
测得浓 度
计算 测得 浓 度 与 相 对误 差
加 权 最 小 二 乘法 结 果
加入 浓 度
分 析 物 内标 物
色谱峰高 比
耐
相对误差
写
权重
测得浓度
相对误差
日 月 ‘ 乙任 任 己 （‘ 月曰 以 ‘ 了八
几
一 一
一
一 一
一
截距 斜率
相关系数
一
表
加入浓 度
样品
低
、
中
、
高
个浓 度点
,
每点
个样品
,
由 上 述 标 准 曲 线分 别 计 算 测 得 浓 度与 相 对 误 差
加权 最 小二 乘法 结果 测得 浓度
分 析 物 内标 物
色谱 峰高 比
普 通 最 小 二 乘 法 结果
测 得浓度
相对 误 差
相对误 差
一
一 一
一 一
一
两 条 回归 直 线法
对 普 通 最 小 二 乘 法 的一 种 改
、
测 定时
,
需 逐 个 考 虑 应 用 哪 条 回 归 直 线 计算 浓 度
。
这
多
良措 施 是 将 测 量 浓 度 范 围 分 为 高
低
个区间
,
每个
合起
,
样
了
,
在 建立 标准 曲 线 时 既 增 加 了 样 品 分 析 工 作 量 个 浓度 点
,
区 间分 别 用 普 通 最 小 二 乘 法 求 得 一 条 回 归 直 线
,
计 算 工 作也 比 较 繁 琐
。
来 作 为 标 准 曲线 这 样
。
,
由 于 每 个 区 间浓 度 范 围 变 窄
,
多 项 式 拟 合 的 回 归 曲线
用 于 生物样 品测 定的
测 量 值绝对 误 差 的变化 也相应 减 小
部 分 地 弥 补 了普
色 谱分析 方 法 性
,
,
其浓度 与响应 的 函 数关 系通 常呈 线
,
通 最 小 二 乘 法 的上 述 缺 陷 缺点
,
。
然而
,
这一方法存 在 一些
个浓
,
仅 在 少 数情形 下
在 高 浓 度 区 域 或极 低 浓 度 区 域
因 而 有 人 采 用 多项 式 拟 合 曲线
,
按规范要求
,
,
每条 标准 曲线 至 少 应 包 括
会发 生 对 直 线 的偏 离
,
。
度 点 这样 两 条 回 归 直 线共 将 包 括 至 少 其 中第
此
,
个浓度点
,
的 回 归方法 一 般 是 增 设 二 次项 即 采 用
,
。
一
,
点和 第
点之 间的 区 段 为 条 回 归直 线 的交 点
,
个 区 间共 有
因
的 形 式 这 在 响应 函 数 不 呈 线性 时是 可取 的 但 若
需 要 计算
在 进 行未 知样 品
一 般 地 以 这 种 形 式 的标 准 曲线来 代替普 通最 小二 乘
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,
法求算的 回 归直线
,
则仍然不适宜
。
其原 因 在于
,
一
对 于 权 重 因 子 的选 择 依 据 是
它 应 使 各 测 定 点具
。
方 面 对 于 不 呈 线性 关 系的标 准 曲线
多
,
规 范要 求测 定更
,
有适 当的权 重
,
由此 算 得 的 标准 曲线 应 尽 可 能 使 各 浓 由式
后
‘
,
的 浓 度 点 以 确 定 浓 度 与 响应 的 关 系
测试与
度 点 测 量 值 的相 对 误 差 都 符 合规 范 的 要 求 可知
和
,
计算的
作 量 都
要 增 加
三
一
,
另一方面
’
,
如 果 这 种 回 归运
,
。
各个
,
。
‘
值 乘 以 同 一 个 常数
中
,
对
、
算仍 旧 是 以
为 目标 则 同样 不 能 很 好 显
的值 并 无 影 响 所 以 关键 是 确 定 各 个
在 通 常 采 用 的方 法 ,
,
值之 间
‘
地 解 决低 浓 度 区 域 分 析 结果 相 对偏差 畸大的 间题
然
,
的相 对 比 例 关 系
是令
根 据 生 物 分 析 方 法 的 特 殊性
一
’
,
,
回 归运 算 只 有 以 测
,
与测 量 值
这里
,
,
,
的方 差 成 反 比
‘
即
量 值 相 对 偏 差 的 平 方 和 最 小 为 目标
即达 到
。
艺
」 才有 可 能 获 得 最 佳 的 标 准 曲线
的值 可 由 适 当 的 模 型 表 达 式 求 算
、
,
或者通过
关 于 加权 最小二 乘法 原理
近年来
,
对 每个
值 的平 行 测 量 求 得
产
‘
。
但是
,
我 们在 生物分析
实 际 工作 中 采 用 最 多 的是
分 析 方法委 员会
推 荐 使 用 加 权 回 归 方 程 检 查 标 准 曲线 的
令 或
‘’
,
线 性 川 与 普 通 最 小 二 乘法 不 同 的是 加 权 最 小 二 乘 法
,
。
我 们 的 目标是 通 过 选 择 权 重 因子 使
’ ,
,
艺
〔
一
、
在 回 归 计算 时增 加 了
艺
‘
个权
由于
’
值预先未 知
。 。
,
这 里 的 假 定 条件 是
重因 子
,
即通 过 达 到
。
矶一
’ ’,
来求算 回
,
‘’
值与
‘
值或
值 成 正 比 这 样 也 非常便 于 用 电子
按式
和式
归 直线 的斜率 和 截距 差成反 比
,
计算时
,
一 般 使权 重 与 绝 对 误
计 算 机 处 理 日常 分 析 数 据
的 结 果 往 往 非 常接 近 些情形下
,
,
算出
。
亦 即 将 大 的 权 重 赋 予绝 对 误 差 小 的 点
。
而
可 根 据 习 惯选 定 或式
,
。
种
但在某
小 的权 重 赋 予 绝 对 误 差 大 的 点
回 归直线
把 以 这 种 方法 求 算 的
,
按式
确定权 重 因子 显得 对 从 而导 致高浓度 点的
,
或 曲线
作 为 生 物 分 析 标准 曲 线
可使 生
标 准 曲线 上 低 浓 度 点 加 权 过 重
测 量 值准 确性 损 失 过 多
物 祥 品 的 测 定 结 果 与理 论 值 的相 对 偏 差 在 不 同 的 浓 度 区 间 内比较均 衡
,
这时
可适 当 降低 低 浓 度 点
确定权重 因子
易 干 满 足 规 范 的要 求
、
,
从一个方
的权 重 的水 平 令
,
如将 最 低 浓 度 点 的 权 重 因 子 降至 次 低 浓 度 点 还 可按 式
,
。
面 保 证 厂生 物 利 用 度
生 物 等 效性 与药 物 动 力 学 研 究
或式
,
数 据 的可靠 性 在理论上
个特例
,
,
。
,
普 通 最 小 二 乘 法 是 加权 最 小 二 乘 法 的
。
或 总之
,
一
‘
即 每个 浓 度 点 的权 重 因 子 均 相 等
,
一般说
权重 因子有 多 种模式
,
,
可 根 据每 种 分 析方
。
来 与 加 权 回 归直 线 相 比 未 加 权 的 回 归直 线 近于
,
值更接
,
。
法 的测 量 结 果 作 出选 择 或 调 整
在 生 物 分 析 中 的应 用
然 后 确定 下来
在 高浓 度 区 域 的测 量 结 果相对误差略 小 但 在 显
低 浓 度 区 域的测 量结果 相对误差 增大极 为显 著
然
,
对表
中 的数 据 以 加 权 最 小二 乘 法 计 算 标 准 曲 给 出 的权 重 因 子
、
。
不能简单地 以
值 的高 低 来 评 价 这
。
种 不 同 线性 加权最 小二 乘
。
线
,
采用式
,
获得 的 结 果 比 普通
。
回 归 方 法 所 获 得 的 标 准 曲线 的 优 劣
最 小二 乘 法 好 得 多 见 表
中相 对 误 差 的对 比
这
回 归 直 线 方 程 参 数 的计算 公 式
是 非 常典 型 的 情 形
生物利用度
、
法 回 归 直 线 参 数 方 程 的 计 算 比 未 加 权 的要 复 杂 提供 的是 回 归方程 关 系数
乏
艺林
艺
尸
,
以下
作 者 多 年 来 在 国 内外 进 行 的近
项关 于 制剂 的
,
一
。
中截 距
一
乏
,
、
斜率
, ,
及相
‘
生 物等效性 及药物动力学 研 究中
、
对于
犷
的计 算公式
乏 艺
公 式 的导 出参 见 有 关文 献 , 气
艺
包括 紫外
、
、
荧光
电化 学 检 测 的
法 以 及 电子 捕
,
获 质谱检测 的
法 等 诸 多 生 物 分 析 方 法 多采 用 加
,
一
一
艺
艺
,
权 最 小 二 乘 法 求 算 单 一 的直 线方 程 作 为 标 准 曲线
艺
,
既
芝 艺 乏 乏
、
。
乏
一
,
艺
包 括 在 方 法 建 立 阶 段 每 个 浓 度 点 多重 样 品 的 情 况 况
。
,
也
。倍
十
一
公
‘
艺 艺
、
“
包 括 在 未 知 样 品 分 析 阶 段 每 个 浓 度 点 单 一 样 品 的情
一艺
仅 在 测 定 浓 度 范 围 特宽 的少 数情 形 下
‘
,
如 上 下 限 比值 在
。
实际 应 用 时可编制
程 序 或使用
。
以上
采用不 同浓 度 区 间 组 合 的方法
’
条 回 归直 权重 因
等计算软 件
,
在 微 机 上 计算
线
均 用 加 权 最 小 二 乘 法 求算
权重 因 子 的选择
子多在采用
时
样 品 的测 量 准 确性 最
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・
・
药物分 析 杂 志
。
佳
,
即 各 浓 度 点 测 量 值 的相 对 误 差 均 较 小
,
在约
。
,
一
,
,
的分析 方 法 中
综 上 所述
权重 因子采用
一
时最 佳
,
,
对 于 保证 生物 分 析 数据 的质 量
。
采用
一
,
,
何 种 算 法 建 立 标 准 曲线 至 为 重 要
本文介 绍 的加 权最
,
,
小二 乘 法针 对 生 物 分 析方 法 测 定 浓 度 范 围宽 的特 点
应 用 了适 当 的权重 因子
品
。
一
一
,
对 保证 每个分 析 批 的
,
样
,
,
尤 其 是 低 浓 度 的样 品
测 量 准 确 性
满 足 规 范要 求
,
,
一
一
一
起到 了重要作 用
至 于 普 通 最 小 二乘法
,
它仅适用于
,
,
一
一
一
那些 测 定浓 度 范 围 窄 的 分 析 方 法
均 匀 度分析等 用
。
如 制剂 含量 或含 量
萧 参等
,
,
,
,
在 建 立 生 物 分 析 标 准 曲 线 时应 避 免 使
生 物 药剂 分 析 方 法 的认 证
中国药学 杂志
,
感 谢 本 校 研 究 生 李 雪 庆 为 本 文 整理 资料 并提 出 建 设性 意
见
。
一
,
一
一
,
,
参考 文献
,
许
一 一
禄
化学 计 量 学 方 法
第一 版
北京
科 学 出版 社
,
考
,
,
,
本文于
一
年
月
日收 到
肿瘤坏 死 因 子 检 测技 术 的 进 展 林
中 国 药 品 生 物 制 品检 定 所
缨
北京
生 化药 品与基 因工 程 药物 室
肿 瘤坏 死 因 子 一 种 具 有 多 种 生 物 学 活 性 的 细 胞 因子
,
,
是
、
体 内测 定 法 研 究 的 初 期 阶 段 所 采 用 的 就 是 体 内法 是根据
,
它 参与 机 体 免 组 织损
它
疫 系 统 的功 能 调 节
,
并 在 感 染 性 疾 病 的发 生
。
使 小 鼠移 植 性 肿 瘤 产 生 出血 性 坏 死 的 程 的活性川
判 断 比较 粗 糙
,
。
伤 和 炎 症 等诸 多 方 面 起 重 要 的 介 质 作 用 川 表 明血 清 中 断 和 预后 川
。
研 究 资料
度来判定
的方 法
,
这 只 是 一 种 定性 或 半 定 量
很 快 就 被 体外 法 所 取 代 了
。
浓 度 的 检 测 有 助 于 对 疾病 的分期 诊
另 一 方面
, ,
对 多 种 肿 瘤 细 胞 都具 有
,
体外测定 法
体 外 检 测 法 的 实验 因 素 要 比 体 内 法 易 于 控 制
,
直接 的杀伤作用
生 物 制剂 之 一 川
很 有 希 望 成 为 未 来 治 疗 肿 瘤 的重 要
随 着 研 究 工 作 的 不 断深 入
。
对
。
结 果 比较 准 确
,
、
客观
,
重 复性
、
相 关性 好
。
。
体外
的浓 度 和 活 性 进 行 准 确 检 测 便 愈 发 显 得 重 要
因 此对
法根 据 原 理 不 同
又 可 分 为 以 下几 种
检 测 技术进行 全面深 入 的 了解是 十分 必 要和 有
益的
,
生 物 学 检 测 方法
这也将有助 于 对
生 理 和病理 作用 机制 的
。
的 生 物 学 检 测 方 法 中应 用 最 广 泛 的 是 细 胞
研究以及
法两类
。
制 品 的纯 化 和 生 产
毒性 法 另外 还 可 根 据
,
的其 它 生 物 学 作 用 如 抑
,
活 性 的 检 测 可 分 为 体 内测 定 法 和 体 外 测 定
制 脂 蛋 白脂 酶
活性 ,
、
抗病 毒及 刺 激 前 列 腺 素的产 生 来 检 测
〕
。
但
的这 些 作 用 易 受 其 它 生 物 学
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