CHO 细胞表达系统研究新进展

CHO 细胞表达系统研究新进展

申烨华　耿信笃3

(西北大学现代分离科学研究所, 陕西省现代分离科学重点实验室, 西安　710069)

摘要　中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell ) 是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。本

文综述近几年来该系统在生产基因工程药物方面的研究进展、存在问题和发展方向。关键词　中国仓鼠卵巢细胞(CHO Cell ) 　基因工程药物　表达系统

细胞中获得了高效表

, , 例如EPO 、G 2CHO 细胞表达、存在问题和发展方向作一简要的总结和评述。

表1　用于生产基因工程药物的表达系统

表达系统

特点

产量

参考文献

1　引言

诞生于70他药物无法比拟的优点, 个引人瞩目的领域。售额约为4860亿美元, 年增长率达20%以上[1]增长热点而给予了大力支持。基因工程药物研究与开发的主要环节包括:①基因的克隆和基因工程菌的构造; ②重组细胞的培养; ③目的产物的分离纯化等。针对这些主要环节, 研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展, 目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1) 。大肠杆菌(E. coli ) 是使用最早的表达系统, 其显著优点是易于操作, 产量高, 成本低, 但由于用E. coli 生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解, 因此它的药效大大降低。此外, 它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中, CHO 细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体

具有原核细胞良好的

原可操作性, 成本低, 产核率高, 但不能进行糖生(Ecoli )

基化修饰, 胞内分泌物

形成包涵体

外源蛋白占细菌总蛋白量:胞内表达10—70%, 胞外表达013—4%

[2]

兼具原核细胞良好的

可操作性和真核系统

酵母外源蛋白占菌体总

的后加工能力, 但存

(yeasts ) 蛋白量:～10%

在产量低及过度糖基化等问题第二代酵母表达系

统, 部分克服了利用型酵母酵母表达的过度糖基

外源蛋白占菌体总

(Methy 2化缺点, 有较好的分

蛋白量:10-30%

lotrophic 泌性, 产量较高, 但产

品结构与天然分子仍

真yeasts )

有一些差异核

生具有高等真核生物表物

达系统的优点, 产品的抗原性、免疫原性

发酵液中目的产物

和功能与天然蛋白质

含量:1-500mg/L

相似, 表达水平较高, 但其糖基化程度较低, 形式较为单一产品的抗原性、免疫

原性和功能与天然蛋发酵液中目的产物

白质最接近, 糖基化含量:012-细胞

等后加工最准确, 表200mg/L 达水平较低

[3]

[3]

系[6,7]。因为与其他表达系统相比, 它具有许多优点:①具有准确的转录后修饰功能, 表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子[8]; ②具有产物胞外分泌功能, 便于下游产物分离纯化; ③具有重组基因的高效扩增和表达能力; ④具有贴壁生长特性, 且有较高的耐受剪切力和渗透压能力, 可以进行悬浮培养, 表达水平较高; ⑤CHO 细胞属于成纤维细胞(fibrob 2last ) , 很少分泌自身的内源蛋白, 利于外源蛋白的后分离。但CHO 细胞培养成本高, 条件难掌握, 易污染, 在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有

　　3通讯联系人

[4]

[5]

23

表2　某些利用CHO 细胞表达的外源基因

药用蛋白

G 2CSF FSH EPO Pro 2U K IL 26IL 212

等[23]比较了SV40、L TR 和CMV 在CHO 细胞中的表达活性, 认为三种启动子的转录活性依次为CMV 启动子>SV40启动子>L TR 启动子, 前者分别是后两者的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子, 如T7启动子也可用于动物细胞。T7启动子能被T7RNA 聚合酶特异识别, 依此建立起来的偶联系统

产量

μg/l ×90106cell/24h μ5-5. 6g/ml/72h

14mg/L/24h 10085U/ml

500-1000IU/106cell/24h 800-1500IU/106cell/24h

参考文献

[9][10][11][12][13]

具有常规表达系统不能实现的高效表达特性[24,25]。除了这些常用的启动子之外, 还有多种强的启动子被用于CHO 细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的

启动子[26], 金属硫蛋白(MT ) 基因的启动子等[13]。响[12,27]和AdMLP 之后CHO 细胞表达EPO 的水平

　

[14][15][16][17][18][19]20]

μg/106cell/24h 36. 8

105U/ml

γ) IFN (

AT ⅢCAMPATH 21H

GPI TIMP

μ4. 9g/ml

μg/106cell/24h 67. 9±8. 0

131. 1mg/L/122h 0. 64mg/ml

16倍。在实际应用中所有的生产细组成型启动子[22]。SR α启动子

(SV40早期启动子+HTLV ) 比SV40早期启动子表达水平提高约5倍[13,28]。

与启动子相连的是增强子元件, 也是一种调节基因转录的顺式作用元件, 具有种和组织特异性。病毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA 帽子位点附近, 从而形成紧密型表达载体。CHO 细胞中一般使用SV40和CMV 增强子。增强

μ180g/ml

2　研究进展

素很多, 层次也很广泛, 涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平, 其中mRNA 的转录是真核基因表达调节的基本控制点, 它的翻译对表达水平也有一定作用。研究表明, 所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关, 主要是通过载体构建、基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis 2acting element ) 与反式作用因子(trans 2acting factor ) 的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此, 表达载体的元件组成及结构是CHO 细胞高效表达外源基因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论, 可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中, 使其方便而高效地用于外源基因的表达。目前在这一理论指导下, 已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体, 它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A 信号等。211　启动子

子可位于载体中两个启动子之间, 为两个启动子公用[5]。212　外源基因

位于启动子之后的是克隆的基因序列, 或被表达的外源蛋白的cDNA 。外源基因的结构可在翻译水平上调控它的表达效率, 这种调控机理很复杂, 目前尚不清楚[12]。但是在启动子一定的情况下, 可以通过下列方法增加外源基因的表达量[19,29-35]:①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA 合成的内含子序列; ②引入一个促进mRNA 翻译的序列; ③拼接一个重组蛋白的信号前导肽, 它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等; ④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列, 解决密码子偏性问题; ⑤尽量切除cDNA 中的不必要序列, 一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗, 另一方面减少5′2未翻译前导区和克隆中的GC 尾部对表达水平的不良影响, 以及减少3′2未

翻译区(3′2U TR ) 对mRNA 稳定性的不良影响。例如, 人G 2CSF 基因的3′2U TR 中富含A T 元素(ARE ) ,ARE 与mRNA 的半衰期有关, 切除ARE 可以增加mRNA 的稳定性, 提高蛋白质的合成; ⑥向转染靶细胞中导入表达载体启动子相应的强反式

启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用, 所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP 、L TR 和CMV 启动子在CHO 细胞中效果良好[23]。刘文军24

激活因子是提高外源基因表达的新策略。213　终止区域

统具有更高的扩增效率。Bebbinglon 等人[44]利用GS 系统生产嵌合抗体, 表达水平达200-500mg/106/48h 。3　存在的问题

为了使外源基因得到准确表达, 其后是强的终止子区域。终止子一般从病毒基因组, 如SV40、T 抗原终止信号、肝炎表面抗原序列或β2珠蛋白等中获得。不同的3′2未编码区(U TR ) 序列能影响重组系统的表达。Rotondaro 等[9]使用两个不同的3′—未翻译区表达人G 2CSF , 结果包含兔β12珠蛋白基因第二内含子和聚腺苷酸信号的3′2U TR 的表达效率高于包含SV40小t 内含子和早期区域腺苷酸化信号的3′2U TR 的表达效率。214　选择标记

在过去的几十年里, 人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发, 取得了很大进展, 但是利

用CHO 细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求, 目前上游工作中主要存在以下问题:①构建的重组CHO 细胞生产效率低, 产物浓度亦低; ②定, ; , ; ④重组细胞培养费用昂贵, 自动化水平低下。4　展望

要从细胞中选择出获得了外源DNA 并稳定转化的动物细胞是很困难的。为此, 或另一个质粒上, ]的有DHFR 、Neo 析, 研究者们还在殊物理性质的报告基因。如Trudy H 等人[36]将E. coli Lac z 基因克隆到载体上, 通过简单的比色实验

在今后的若干年内, 随着以CHO 细胞为主的动物细胞表达系统日趋完善, 动物细胞将可能成为生产基因工程药物的主要宿主细胞。围绕CHO 细胞表达系统而进行的相关研究将成为生物工程领域一个活跃的研究热点。科研人员将把以下问题作为今后的主攻方向:①提高表达水平, 如发展一些新的强启动子, 寻找合适的增强子, 装配适合于cDNA 高效表达的必要元件以及根据CHO 细胞翻译特点, 调整外源基因密码子等[45]; ②在进一步提高表达水平的同时, 还将注重分离纯化的问题, 如改变DNA 中的个别序列, 使表达产物在不影响生物活性的前提下, 携带有利于分离纯化的基团; ③细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化、自动化、精巧化; ④分离纯化的低成本和高活性回收率。

致谢　本文完成后承蒙北京大学生物系茹柄根教授和中国预防医学科学院病毒学研究所所长阮力研究员提出宝贵意见并予以修正指正, 在此特表谢意。

便可快速测定出β2半乳糖苷酸的活性, 细胞在无菌条件下分析后还可继续培养。分泌碱性磷酸酶的基因也有类似的功效[37]。其它类型的报告基因在检测时不甚便利[38-40], 因为它们或者要求放射性基质, 或者要求特殊仪器以测定发光物质或荧光物质。215　基因扩增

外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲, 表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成:外源基因表达单元和扩增基因表达单元。扩增基因往往亦为选择标记。迄今为止, 世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统[41], 其中二氢叶

酸还原酶(dhfr ) 基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。而谷氨酰胺合成酶(GS ) 扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统

[42]

。宿主细胞为

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CHO 2k 1细胞。在这个系统中质粒p EE14被整合入

染色体, 使外源基因在人巨细胞病毒(h 2CMV5) 和SV403′2端控制下进行表达。选择标记基因是从SV40晚期启动子转录而来, 其中包括一个小基因,

一个内含子和3′2侧翼约1kb DNA 。GS 基因的选择压力是低水平的MSX , 在这一选择压力下, 细胞内的外源基因拷贝数可达1000-2000拷贝/细胞。GS 基因扩增前后,CA T 基因的表达水平提高了19-20倍左右[43]。与dhfr 基因扩增系统相比, GS 系

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(下转第22页)

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Advances in Molecular Biology of Plant ———P athogenic Fungus Interaction

Lan Haiyan 　Chen Zhenghua

(Institute of G enetics , The Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100101)

Abstract 　In this paper ,we summarized the advances in molecular biology of plant 2pathogenic fungus inter 2action from following aspects :interactionbetween pathogenic genes ,avirulence its products of fungi , and resistant genes ,defensive genes and its products of plants aquired re 2sistance ,etc. (接第25页)

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The R ecent Progress in the Upstream Studies on the Culture with CH O Cell

Shen Y ehua 　G eng Xingdu

(Institute of Modern Separation Science ,Northwest University and the Key laboratory of

Modern Separation Science of Shaanxi Province ,Xian 710069)

Abstract 　Chinese Hamster Overy (CHO ) cell is presently the chief expression system for the producing recombinant glycosylated protein. In this review paper mainly focus on the review of ,the recent progress prob 2lems ,int he future about this expression system for producing therapeutic proteins produced in biotechnology.

K ey w ords 　CHO cell ,genetic engineered drug ,expression system. 22