成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析

—1212—34（7）药物分析杂志ChinJPharmAnal2014，

*

成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析

＊

于传飞，郭玮，王兰，张峰，刘春雨，王文波，李萌，王军志，高凯＊

（中国食品药品检定研究院，北京100050）

摘要

目的：采用成像毛细管等点聚焦电泳法分析单克隆抗体制品的电荷异质性。方法：应用优化的成像毛细管等点聚焦电

泳技术，对2种单克隆抗体制品酶切处理前后进行电荷异质性分析。结果：羧肽酶B处理前后的抗体1成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性引起；羧肽酶B处理和/或N－糖苷酶处理前后的抗体2成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性和N－糖的唾液酸修饰引起。结论：采用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术，可较好地分析单克隆抗体产品的电荷异质性；并且配合合适的酶切处理，可判断单克隆抗体产品主要电荷异质性的来源，为保证单克隆抗体产品技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。关键词：单克隆抗体；电荷异质性；成像毛细管等点聚焦电泳；C末端赖氨酸不均一性；N－糖末端唾液酸修饰中图分类号：Ｒ917

文献标识码：A

文章编号：0254－1793（2014）07－1212－04

Chargeheterogeneityanalysisofmonoclonalantibody

productswithimagingcapillaryisoelectricfocusingelectrophoresis*

YUChuan－fei，GUOWei，WANGLan，ZHANGFeng，LIUChun－yu，

＊

WANGWen－bo，LIMeng，WANGJun－zhi，GAOKai＊

（NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China）

AbstractObjective：Toinvestigatethechargeheterogeneityofmonoclonalantibodyproductswithimagingcapil-

laryisoelectricfocusingelectrophoresis（iCIEF）．Methods：WiththeoptimizediCIEF，thechargeheterogeneityoftwomonoclonalantibodyproductswasanalyzedbeforeandafterenzymetreatments．Ｒesults：TheiCIEFresultsbe-foreandafterCpBenzymatictreatmentshowedthatthechargeheterogeneityofantibody1wasmainlycausedbyheterogeneityofC－terminallysine；theiCIEFresultsbeforeandafterCpBand/orPNGaseenzymatictreatmentsprovedthatthechargeheterogeneityofantibody2wascausedbyheterogeneityofC－terminallysineandsialicacidmodificationatN－glycanterminus．Conclusion：Withtheoptimizedtechniqueofimagingcapillaryisoelectricfo-cusingelectrophoresis，thechargeheterogeneityofmonoclonalantibodyproductscouldbewellanalyzed．Whileincombinationwithappropriateenzymatictreatments，themainoriginofheterogeneitycouldbedetermined．Thetech-niqueprovidesaneffectivetoolforensuringthestabilityofproductionprocedureandqualitycontrolofmonoclonalantibodyproducts．

Keywords：monoclonalantibody；chargeheterogeneity；imagingcapillaryisoelectricfocusingelectrophoresis；Cter-minallysineheterogeneity；sialicacidmodificationatN－glycanterminus单抗类制品的多种翻译后修饰可导致其电荷异质性，而某些电荷异质性由于对单抗稳定性及其生物学功能发挥具有重要的影响而成为关键质量属性（CQA），并且电荷异质性可反映其生产工

艺的稳定性，所以受到生物技术产业界及监管机

构密切关注。

1994年，成像毛细管等点聚焦电泳技术及其相应仪器成像毛细管等点聚焦电泳仪（iCE280）被发

*“重点新药创制”国家科技重大专项（编号：2014ZX09304311－001）

Tel：（010）67095707；E－mail：gaokai@nicpbp．org．cnTel：（010）；E－mail：vuchuanfei@126．com

第一作者

＊＊通讯作者

明，解决了常规毛细管等点聚焦电泳技术谱带展宽

变形的问题。该技术只需要高电压聚焦过程在毛细管中将各个组分根据不同的等电点进行分离，然后对整个毛细管柱进行实时扫描。该技术使等电聚焦时间显著缩短，分离度提高，显著改善了分析结果重复性。成像毛细管等电聚焦电泳自发明

［1－5］

。本以来在生物医药生产中受到广泛的应用

研究利用该技术分析了2种抗体的电荷异质性，

1μL的pImarker7.05、1μL的pI甲基纤维素、

marker9.46、2μL的Pharmalytes3－10、6μL的Pharmalytes8－10.5、20μL的1%（v/v）的TEMED和95μL超纯水混匀。2.2

成像毛细管等点聚焦电泳分析条件

持续1min；聚焦电压3预聚焦电压1.5kV，

kV，持续10min，样品管理器温度设置为8℃。

2.3结果2.3.1

抗体1羧肽酶B处理前后的成像毛细管等

点聚焦电泳检测结果表明，应用iCE280成像毛细

并结合酶切对2种抗体电荷异质性形成的原因做

了初步研究。1

供试品与仪器

供试品抗体1为抗IL－1β单抗，抗体2为抗IL－12/IL－23p40单抗，两者均为全人源的IgG1型单抗，由鼠源性杂交瘤细胞SP2/0表达，两者均为本室留样。

载体两性电解质Pharmalyte3－10（货号：17－0456－01）及8－10.5（货号：17－0455－01）购自GEHealthcare公司；iCE280试剂盒（包括1%、0.5%甲基纤维素，阳极及阴极电解液，货号：102506）和pImarkers7.05（货号：102226）、7.55（货

9.46（货号：102349）和10.10（货号：号：102170）、

102232）购自ProteinSimple公司；尿素购自SeakyBio

公司，货号为24524；N－糖苷酶F（PNGase）购自Sigma公司，货号为P0704；TEMED溶液购自SEＲ-VA公司，货号为35925；羧肽酶B（CpB）购自罗氏公司，货号：[1**********]；超滤管购自Millipore公司。

iCE280分析仪和Prince微量注射器自动进样FC－膜色谱柱筒（5cm×100μm）、器、自动进样玻璃瓶（250μL）和自动进样瓶（4mL）购自Protein-Simple公司。22.12.1.1

方法与结果样品处理

管电泳技术可较好地分析抗体1的电荷异质性，具有较高的分离度，如图1－A所示。为判断末端赖氨将抗体1用羧肽酸不均一性对其电荷异质性的贡献，

继续分析其电荷异质性，酶B去除C末端赖氨酸后，

结果如图1－B所示。抗体1主峰后的2个碱性峰均

消失，证明这2个碱性峰为C末端赖氨酸不均一性所引起。经羧肽酶B酶切后的抗体1除了1个含量较

基本上只剩1个主峰，证明抗体1的低的酸性峰外，

电荷异质性主要源于C末端赖氨酸的不均一性

。

末端赖氨酸切除处理将样品用去离子水

－1

稀释至10mg·mL，在10μL稀释后样品中加入5

mg·mL－1的羧肽酶B1μL，室温孵育30min。2.1.2N－糖切除处理用10kD超滤离心管将样品的原缓冲液置换为20mmol·L碳酸氢铵溶液，将

－1

样品浓度调至10mg·mL，然后在20μL样品中加入N－糖苷酶（5×105U·mL－1）1μL，37℃酶切过夜。2.1.3样品上机前处理对于抗体1，将5μL抗1μL的pImarker体与70μL的1%甲基纤维素、7.55、1μL的pImarker10.10、2μL的Pharmalytes3－10、6μL的Pharmalytes8－10.5和115μL超纯水混匀。对于抗体2，将5μL样品与70μL的1%

图1Fig1

抗体1经羧肽酶B酶切前（A）、后（B）处理的成像毛细管等电iCIEFelectrophetogramsofsample1before（A）andafter（B）en-聚焦电泳图谱。

zymatictreatmentofCpBseparately

－1

2.3.2抗体2先经羧肽酶B后经N－糖苷酶酶切

处理前后的成像毛细管等电聚焦电泳应用

iCE280成像毛细管电泳技术同样也可较好地分析抗体2的电荷异质性，具有较高的分离度，如图2－A所示。为判断末端赖氨酸不均一性对其电荷异质将抗体2用羧肽酶B去除C末端赖氨酸性的贡献，

后，分析其电荷异质性，结果如图2－B所示。抗体2主峰后的2个碱性峰均消失，证明这2

个碱性峰

为C末端赖氨酸不均一性所引起。但是经羧肽酶B

酶切后，其主峰前仍有2个比例较高的酸性峰，为判断唾液酸修饰对其电荷异质性的贡献，将羧肽酶B酶切后的抗体2继续用N－糖苷酶酶切，分析其电荷异质性，结果图图2－C所示，经过2个酶切处理

抗体2的图谱基本上只剩1个主峰，证明抗体2后，

的电荷异质性主要是有C末端赖氨酸的不均一性和唾液酸修饰所引起。2.3.3

抗体2先经N－糖苷酶后经羧肽酶B酶切

处理后的成像毛细管等电聚焦电泳由于抗体2的

电荷异质性较强，为了进一步确证其异质性主要由C末端赖氨酸的不均一性和唾液酸修饰引起，改变即先用N－糖苷酶再用羧肽酶B酶切处酶切顺序，

用N－糖苷酶处理以后理抗体2。如图3－A所示，

3个酸性峰消失。值得注意的是，经过N－糖苷酶处理以后，由于N糖连接的天冬酰胺变成天冬氨酸，整个峰都会左移。接着再用羧肽酶B处理以后

，

图2Fig2

抗体2未经处理（A）、经羧肽酶B酶切（B）、先经羧肽酶B后iCIEFelectropherogramsofsample2beforeenzymatictreatment

图3Fig3

抗体2经N－糖苷酶酶切（A）、先经N－糖苷酶后经羧肽酶BiCIEFelectropherogramsofsample2afterPNGaseenzymatic

经N－糖苷酶酶切（C）后的成像毛细管等电聚焦电泳图谱

（A），afterCpBenzymatictreatment（B）andconsecutiveCpBandPN-Gaseenzymatictreatmentsseparately（C）

酶切（B）后的成像毛细管等电聚焦电泳图谱

treatment（A）andconsecutivePNGaseandCpBenzymatictreatmentsseparately（B）

图谱如图3－B所示，结果和图2－C类似，说明图

3－A主峰后的2个碱性峰是由C末端赖氨酸的不均一性所引起的。进一步证明抗体的电荷异质性主要是由C末端赖氨酸的不均一性和唾液酸修饰引起的。3

讨论

由于单抗的分子量巨大，在生产及储存过程中可

N末端的焦谷氨酸化、C末产生大量的修饰，如糖基化、端的赖氨酸截除、氧化、脱酰胺等等，理论上这些异质

8

性的组合可使单抗分子产生约10种异构体。这些异构体的组合形成了单抗的大小异质性、电荷异质性和

［6］

糖基化修饰的异质性等。电荷异质性其碱性峰来源于C末端赖氨酸的不均一性、甲硫氨酸氧化、天冬氨酸

其中主要为C末端赖氨酸的不转变为丁二酰亚胺等，

均一性；酸性峰则来源于N－糖末端的唾液酸化修饰、

氨基酸残基的脱酰胺等，而其中对于SP2/0和NSO细胞所表达的单抗而言主要为唾液酸化修饰。单抗的电荷异质性产生的原因对于单抗的药效

例如C末端的赖氨酸由于距离抗体主学影响各异，

要功能结构域较远，其缺失与否对功能并无影

［8］

响；N－糖末端的唾液酸化修饰会减少单抗的抗

［9－10］

，体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）

此外唾液酸的N－羟乙酰神经氨酸（NGNA）形式可

［7］

则仍需要配合液质等分析手段进行研究。

由于单抗制品高度复杂的异质性，其质控需要组合多种理化分析技术对其进行检测。对于电荷异质性分析，成像毛细管等电聚焦电泳为对其进行分析提供了一个快速、灵敏、高分离度的选择，对保证单抗类生物技术药物生产工艺的稳定性及控制其质量和提高质量标准均具有重要意义。

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（本文于2013年7月25日收到）

氧化等在人体内引起显著的免疫反应；脱酰胺、

反应若发生在单抗的Fab段会明显影响其与相应抗原的结合力

［12］

［11］

。单抗酸碱峰比例的放行标准应参

照多批次的检测结果、体内外实验以及临床数据确

定，但是首先应该确认产生电荷异质性的原因，而如此复杂的电荷异质性对分析方法提出了巨大的挑战。常规分析单抗类制品电荷异质性的方法包括离子交换色谱法、平板等点聚焦电泳法以及毛细管等电聚焦电泳技术。对于离子色谱法，每种抗体都需要开发相应的方法，其开发周期较长，并且每次操作耗时耗力；平板等点聚焦电泳法操作也比较烦琐，并且分辨率比较低，准确定量比较困难；毛细管等电聚焦电泳技术具有较好的分辨率及定量优势，但是由于聚焦过程后需要通过机械或电场力将聚焦分离的各个组分推至检测窗口进行检测，会导致谱带展宽及变形。本研究表明，成像毛细管等电聚焦电泳在分析单抗类制品的电荷异质性方面具有巨大的优势，此技术不仅对抗体的电荷异质性变体具有良好的分离度，并且结合合适的酶切，可以判断抗体主要电荷变异体形成的原因，比如C末端赖氨酸的不均一性以及唾液酸修饰等，但是应该指出的是，其他比例较小的电荷变异体产生的原因如脱酰胺、氧化、异构化等