体外抗体亲和力成熟的几种策略

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(本文编辑 杨兆弘)

军事医学科学院院刊 2004年6月 第28卷第3期

体外抗体亲和力成熟的几种策略

林 周,黎 燕,沈倍奋

(军事医学科学院基础医学研究所,北京 100850)

[摘要] 抗体在疾病诊断、治疗和预防方面发挥着举足轻重的作用。随着抗体工程技术的不断发展,抗体已经成为生物制药领域中的热点。而抗体工程发展所面临的两大难点问题之一就是如何提高基因工程抗体的亲和力。本文综述了有关基因工程抗体体外抗体亲和力成熟方面的最新进展。[关键词] 抗体工程;抗体亲和力成熟[中图分类号] R392.11 [文献标识码] A[文章编号] 1000_5501(2004)03_0292_03

Severalstrategiesofantibodyaffinitymaturationinvitro

LINZhou,LIYan,SHENBei Fen

(InstituteofBasicMedicalSciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

[Abstract] Itisimportantforantibodytodiagnose,treatandpreventdiseases.Inrecentyears,antibodyengineeringmademoreprogressandbecamethehotspotinthefieldofbiologicalpharmacy.Inthisreview,theadvanceofantibodyaffinitymaturationwhichisoneoftheimportantelementsofantibodyengineeringisdescribed.[Keywords] antibodyengineering;antibodyaffinitymaturation 抗体研究在经历了上个世纪的两次研究热潮后,在世纪之交迎来了第三次研究热潮。这次研究热潮的特点是:它不是以某种技术为核心的研究热潮,而是随着上个世纪80年代基因工程的兴起而随之兴起的以分子生物学为基础的研究热潮[1]。它既包括在分子水平上改造抗体结构,以实现抗体人源化的研究,也包括基于分子水平的体外提高抗体亲和力的研究;还包括不经免疫制备新型基因工程抗体的研究以及构建不同分子大小的种类繁多的抗体衍生分子的研究。本文综述了基于分子水平的体外抗体亲和力成熟的研究进展、该领域的研究现状以及今后可能的发展方向。

熟。它是由于抗体形成细胞本身的基因抗原对B胞克隆的选择性激活。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果,对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。

2 体内抗体亲和力成熟的几种策略

天然B细胞库所产生的抗体一般亲和力较低,不足以对机体提供有效的保护,只有在抗原多次刺激和选择的过程中才使其亲和力逐渐增加。体内抗体亲和力成熟主要是通过以下几种策略来实现的。2.1 抗体基因重排的多样性

这种多样性是抗体亲和力成熟的分子基础。机体内存在一个数量巨大的B细胞克隆库,能够通过表达在膜表面的膜Ig分子识别不同的抗原。通过膜Ig分子与抗原多次的相

[收稿日期] 2003-09-25

(1973-),男,,1 抗体亲和力成熟

抗体亲和力表示抗体与抗原结合能力的大小。抗体亲和力成熟(antibodyaffinitymaturation)是指机体正常存在的一,再次应答所产生抗

军事医学科学院院刊 2004年6月第28卷第3期293

来,人们充分利用抗体的结构特点,提出只对抗体的CDR区,收到了良好的效果。Yang等[3]于1995年、Rader等[4]于1998年分别运用CDR walking的方法,将多个抗体的亲和力提高了数百倍。人们在研究中进一步发现,在抗体轻链、重链的6个CDR区中,并不是所有的CDR区重组都能够获得更高亲和力的抗体,而是仅有其中的几个对于抗体分子进化较为重要。2001年McCall等[5]的研究发现,轻链、重链基因CDR3区的重组对于提高抗体的亲和力起决定性作用,这也从一个侧面印证了这个区域在体内抗体基因片段的重排过程属于热点区域(hot3.3 链改组(shuffling)

技术。这是一种非常简便的抗体体原理,将抗体的一条链保持不变,替换另一条链,亲和力体,已知某一抗体抗原亲和活性,将其一条链(轻链)不变,提供对特定抗原的特异性,将二者随机组合,构建次级抗体库,从中筛选理想的另一条链(重链)与其搭配,这样就增加了抗体的多样性和高亲和力抗体筛选的机会,重复进行链替换和亲和力筛选将产生高亲和力的抗体。不过,这项技术的缺点也很明显:必须对抗原有比较明确的认识,而且要在一个比较完善的初级抗体库或抗体的基础上才能采用此项技术。2000年,Park等[6]成功运用此项技术将一个天然抗体的亲和力提高了65倍,并实现了抗体片段在3.4 DNA改组(shuffling)

年,等[7]提出了运用DNA改组的技术方法,用于快速实现功能蛋白质的体外进化。目前这项技术已经被大量用于抗体的体外亲和力成熟。DNA改组是基于随机突变的原理,获得较大容量的功质突,然后(主要是以噬菌体表面展示技术)对突变体进行筛选,最终得到进化的功能蛋白质分子。

互作用,导致分泌高亲和力抗体的B克隆选择性激活并进一步增殖分化,从而导致抗体亲和力的提高。2.2 体细胞突变

在B细胞的分化过程中,激活后的B细胞克隆抗体可变区基因发生

频率较高的超突变,突变的结果可以是失去活性,亲和力降低或升高。只有突变后亲和力升高的克隆易于被抗原所选择并进一步增殖分化,而丧失活性和亲和力降低的克隆或发生凋亡或生长处于劣势。因此,体液免疫过程中所产生的抗体亲和力越来越高。2.3 免疫记忆的存在

在机体初次接触抗原产生的免疫应答过程中,有相当一部分数量的B细胞克隆最终保留了下来,成为免疫记忆细胞。记忆性的B细胞也存在着以上的突变过程,从而导致其膜Ig分子亲和力的提高。当抗原再次刺激机体时,具有高亲和力膜Ig分子记忆性B细胞就能够迅速与抗原发生相互作用,诱导机体免疫应答。

3 体外抗体亲和力成熟的几种策略

近年来,随着人类对体内抗体亲和力成熟研究的逐步深入,同时抗体工程研究的迅速兴起,使得体外抗体亲和力成熟研究逐渐成为一个研究热点。体外抗体亲和力于体外功能蛋白质分子进化的范畴。它的研究策略多基于对体内抗体亲和力成熟规律认识的基础上提出的,大多模拟体内抗体亲和力成熟的方式。目前主要采用以下几3.1 点突变

,模拟体内体细胞突变而设计的一种体外抗体亲和力成熟的策略。点突变包括随机诱导突变和定向诱导突变。定向诱导突变适合于对基因及表达的蛋白产物的三维结构及功能等方面的信息了解得较为透彻的前提下采用的方法。这种方法的优缺点都是非常突出的。虽然定向诱导突变能够准确地实现目的抗体的分子进化,并且能够获得相关的重要研究信息(如抗体与抗原的作用位点等),但在,特别是在大多数情况下,对目标基因表达产物的高级结构知之甚少,导种方法的成功率不高。随机诱导突变则通过引换,进而筛选理想的突变体。通常,采用错误倾向PCR(error pronePCR)可方便地引进突变。这种方法的关键在于如何选择合适的突变频率。一般有益突变的频率很低,绝大多数突变为有害的。如果突变频率太高,则几乎无法筛选到有益突变;突变频率也不能太低,否则,未发生任何突变的野生型将占突变群体的优势类型,也很难筛选到理想的突变体。总体来看,随机诱导突变的方法带有一定的盲目性,在实际工作中成功率很低。近年来,随着研究人员的不断改进,随机诱导突变技术又有了长足的发展。1999年,Yang等[2]基于随机突变的原理,错误倾向PCR、DNA重组等技术,获得了达到10fmol/L的单链重组抗体。3.2 CDR区重组

,它的恒定区高度保守;在可变区中,也只有与抗原结合密切相关的CDR区他部位也是4 展望

近年来,随着多种抗体药物相继被批准上市,在市场上赢得了丰厚的利润,抗体已取代基因治疗成为生物制药领域的新宠[8]。作为抗体工程中最为重要的分支之一的基因工程抗体技术,其发展也日新月异。有鉴于此,笔者大胆预测未来运用基因工程抗体技术体外提高抗体亲和力技术的一些可能的发展方向:第一,目前体外提高抗体亲和力的策略多局限在模拟体内提高抗体亲和力众多策略中的一种,而忽视了多种策略的协同运用。理论和实践研究均表明,通过多种策略的协同运用,可以有效提高改变抗体亲和力的效率。具体表现在:协同运用DNA改组技术和SIP技术能够既广泛又高效地获得高亲和力的抗体。第二,对于库突变技术来说,库容量和库的多样性是衡量库的质量的重要指标。目前通过发展各种突变技术,理论上能够得到多达1045容量的抗体库[9]。这个容量无疑是一个天文数字!但是如何有效利用并维持这样的抗体库是一个耗费大量物力和人力的工程。,

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将其控制在可操作的范围内,也是目前困扰抗体库技术的一大难题。第三,体外提高抗体亲和力的方法无论如何发展,无非是模仿体内抗体的成熟过程。但是,机体是一个非常复杂的有机整体,有许多机制是体外现的。因此,在某种意义上,应用模式生物,,在小鼠等模式生物的体内模拟体内抗体亲和力的成熟不失为一种事半功倍的有效方法。

军事医学科学院院刊 2004年6月第28卷第3期

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(本文编辑 杨兆弘)

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会议消息

关于举办全军特种医学(核化生、爆炸、恐怖袭击)病理诊断技术培训班的通知

为适应新时期质量建军、科技强军和现代医学科学技术发展的要求,不断提高我军卫生技术干部素质,特别是面对当前国际和国内以核(放射)、化学、生物、爆炸及劫持为主要手段的恐怖袭击日益增多的形势,结合2003年SARS在我国暴发流行和齐齐哈尔市毒剂弹(芥子气)中毒诊断治疗的经验教训,不断提高我军各级病理工作者的诊断和研究水平,经总部批准,将于2004年10月于武汉市举办针对核化生、爆炸和劫持损伤的全军病理诊断技术培训班。

一、教学对象

全军各军区和军兵种总医院、中心医院、基层医院病理科及军医大学和科研院所病理室主任、副主任、主治医师(相应职称)以上病理工作者和从事应对各类恐怖袭击的临床与管理工作者。

二、学习班的内容和形式

1.专家系统讲授;2.观察病理标本;3.观察病理切片(含常规、特染、免疫组化、原位杂交等);4.制作和配发典型病理教学切片、病原体和病理图谱。

三、日程安排及费用

1.时间安排:2004年10月10日全天报到(需接站者请提前告知);10月11~13日授课;10月14日撤离(当日全军第九届病理学术会议报到)。2.食宿:统一安排,费用自理。3.学费:800元(含教材、切片、资料等)。

四、报到地点

湖北省武汉市武昌八一路336号丰颐大酒店。

欲参会者请于2004年7月15日前与军事医学科学院放射医学研究所实验病理研究室联系。地址:北京市海淀区太平路27号,邮编:100850。

联系人及电话:彭瑞云:010-66931236(办),010-66884862(宅),E-mail:[email protected];王德文:010-66931336(办),[1**********]。

中国人民解放军医学科学技术委员会 病理学专业委员会