基因组定点编辑技术的研究进展_张智辉
第25卷 第7期2013年7月生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 25, No. 7
Jul., 2013
文章编号:1004-0374(2013)07-0735-08
∙ 技术与应用 ∙
基因组定点编辑技术的研究进展
张智辉,董少忠*,寸 韡*
(中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,昆明 650118)
摘 要:基因组编辑是建立在基因靶向修饰的基础上,对生物基因组进行改造的一项新技术。通过利用人工核酸酶ZFn、TALEN和细菌获得性免疫系统CRISPR,可在靶位点制造 DNA 双链切口进而诱导细胞内源性修复机制,通过同源重组修复或非同源末端连接途径实现基因敲除、替换和纠正。对目前3个主要的基因组定点编辑技术的应用和发展作一综述。
关键词:定点基因组编辑;锌指核酸酶;TALEN;CRISPR/Cas9
A中图分类号:Q-33;Q78 文献标志码:
Progress in targeted genome editing technologies
ZHANG Zhi-Hui, DONG Shao-Zhong*, CUN Wei*
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Yunnan Key
Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Disease, Kunming 650118, China)
Abstract: Genome editing is a novel technology based on precise genome-targeting modification to enable systematic reverse engineering of causal genetic variation. A set of gene editing techniques, zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases and bacterial CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas adaptive immunity system, have been used to cleave the double-strand DNA at specific site, followed by endogenous DNA repair. These techniques, therefore, make precise changes to the DNA of living cell by, for example, knocking out a gene, correcting a genetic mutation or replacing DNA fragment at the specific site. The new progress in targeted genome editing technologies was discussed in this paper.Key words: targeted genome editing; zinc finger nucleases; TALEN; CRISPR/Cas9
近几年来,科学家一直在寻求更加精确的方法对特定的基因进行敲除或者靶向修饰。20世纪80年代,研究者们可以利用同源重组的方法来对特定的基因进行靶向修饰,但由于自然重组的过程非常
-6
罕见,所以,这种方法效率非常低,只能达到10。之后的研究发现,真核细胞的染色体发生双链断裂时[1],细胞会通过DNA 同源重组或者非同源末端连接机制修复双链断裂[2],在修复过程中会出现高几率的基因缺失、插入和改变。所以,利用各种方法在染色体上的特定位点进行精确切割诱发DNA损伤修复,使得对真核生物进行精确的基因操作成为可能,以此实现特定细胞组织的遗传操作
[3-6]
找到遗传性疾病治疗的有效手段,因此,基因组编辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。2011年,人工核酸酶介导的基因组编辑技术被Nature Methods杂志评选为年度最受关注的技术成果。从当年的技术发展来看,这3种酶包括有3个主要的类型——锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFn)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-收稿日期:2013-03-13; 修回日期:2013-04-26
基金项目:国家科技重大专项重大新药创制课题(2012-ZX09105302);中央高校基本科研业务费专项资金资助(2012Y08)
*通信作者:董少忠,E-mail: [email protected];Tel: 0871-68339287;寸韡,E-mail: [email protected];Tel: 0871-68334579
。
通过在基因组水平上进行精确的基因编辑,可以更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能,
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生命科学第25卷
like effector nucleases, TALEN),以及归巢核酸内切酶(meganuclease)。目前ZFn及TALEN技术已被广泛应用,而归巢核酸内切酶由于改造难度大、成本高,使其应用有所局限。近期,细菌获得性免疫系统CRISPR在人源细胞染色体修饰上的应用使得基因组编辑技术进一步简化。目前,研究人员利用基因组编辑技术,已经对多个物种进行了基因组定
[3,7-14]
。基因组定点编辑技术在未来点敲除或修饰
的动植物基因组改造、基因功能研究等重大的基因
组学问题的解决中将具有广阔的应用前景。
在与靶位点同源的DNA 片段,则细胞主要通过DNA 同源重组的机制修复双链断裂,从而实现靶基因敲除或敲入。
1.2 ZFn的筛选与构建
锌指结构α 螺旋中的–1~+6 位的7 个氨基酸残基(+4 位通常固定为亮氨酸残基)决定了锌指对DNA 序列识别的特异性。其中,–1、+3、+6 位残基直接同三联子靶序列中的3个碱基相互作用,三个残基中任何一个改变都可能会引起其他两个氨基酸残基对目标碱基识别的改变。此外,不同的锌指之间也会相互作用,这种作用被称为ZF的上下文依赖效应,所以,目前对ZF识别的核苷酸序列研究不是完全明了,而大多数研究者并不公布其ZF序列,因此,ZFn在构建和筛选方面存在较大的技术难度。
模块组装是最早出现、较为简单的构建方法,将某个特定的ZF视为一个能够独立识别并结合特定核苷酸三联子的模块。收集经过实验验证的ZF与三联子信息,在两者之间建立一一对应的关系,构成可供挑选的锌指集。在使用时只要把感兴趣的
[22]
序列与ZF一一对应,将多个锌指偶联即可。这种方法没有考虑ZFn的上下文依赖效应,可能会产生较高的脱靶切割效应,引起细胞毒性。
OPEN [23]是ZFn构建中另一个常用的方案,它利用OPEN (Oligomerized Pool Engineering)作为一个共享的锌指资源库,每个锌指库中针对一个特异的三联碱基包含了大量的不同氨基酸序列的锌指识别结构域,通过将不同的库组合在一起可以得到成百上千种ZFn的组合,其中亲和性高的组合将激活下游的药物筛选基因,并在选择培养基中获得竞争优势,最后再通过细菌双杂交,最终筛选获得理想的ZFn。1.3 ZFn的应用
21世纪初期,ZFn技术在基因编辑中逐渐得到广泛的应用。该方法已经在黑腹果蝇
[24]
1 基因组定点编辑技术的初现——锌指核酸酶 (zinc finger nucleases)
1.1 锌指核酸酶的结构及作用原理
锌指(zinc finger, ZF)是一种常见的DNA结合蛋白结构基元,每个锌指可直接特异识别DNA双螺旋中3 个连续的核苷酸。人工串联3~6个识别不同靶位点序列的重组锌指结构,能够与靶序列特异
[15]
性结合。将多个锌指串联形成的ZFP 结构域与IIs型限制性内切酶FokI [16]的切割结构域相连接,就可构建成锌指核酸酶(ZFn),实现对靶序列的切割。增加串连锌指的数目可识别更长的靶序列, 同时也就增加了DNA 靶向修饰的特异性[17-18]。
由于FokI需要二聚化来切割DNA[16],所以,设计好的两个互补的ZFn 分子同时与靶位点结合,当两个互补的ZFn 分子间相距恰当的距离时(6~8 bp),FokI结构域将二聚化并切割DNA(图1),从而可特异性地在基因组特定位点切断DNA形成
[19-21]。双链断裂可以启动细胞内的“双链断裂缺口”
DNA 损伤修复机制,一方面细胞通过错配率很高的“非同源重组末端连接”机制修复双链断裂,从
而在ZFn 靶位点造成随机性的小片段丢失或是插入,引起基因的靶向敲除;另一方面,由于双链断裂使得同源重组效率大大提高,如果细胞内同时存
、斑马
鱼[25-26]、大鼠[27]、小鼠[27]、拟南芥[28]等模式生物
2005年,的中成功实现了靶基因的敲除或定点修饰。Urnov等[29] 首次利用ZFn技术对培养的人类细胞2007年,他们又利用ZFn介导进行了基因敲除;
的同源重组对人类细胞进行了基因定点插入[30];随后,人们相继在多种类型的人类细胞中[29,31],利
用ZFn,采用多种方案实现了多个基因的遗传修饰。
1 DNAZFn技术介导的基因突变使得一些遗传疾病的治疗成为可能。在艾滋病治疗方面,Sangamo
公司
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的 Holmes等尝试使用ZFn技术破坏CD4+ T细胞中的内源基因CCR5,可以使HIV 病毒失去其重要的受体位点之一,从而抑制病毒的繁殖与传播[32]。目前,Sangamo 公司针对CCR5 设计的ZFn 药物已进入三期临床试验阶段。但是,ZFn在遗传疾病治疗方面的使用还需谨慎,脱靶切割和试剂安全性方面的问题是亟需克服的。1.4 ZFn的优势和局限
ZFn的出现使得基因打靶效率能够达到30%左右,比被动的同源重组有了质的提升,并且已经可以做到针对某些特定的序列来设计ZFn实现靶基因的修饰,但也有其发展的局限性,ZFn的识别结构域中存在上下文依赖效应,使得ZFn设计和筛选效率大大降低,所以目前尚无法实现对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFn,也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFn 作用位点,并且在已经成功运用的ZFn的报道中,大多数研究者并不公布其ZF序列。所以,在ZFn的筛选和设计方面还存在较大技术困难,如何构建高特异性的ZFn将成为这个技术未来发展的重点。
另外,由于ZFn的脱靶切割会导致细胞毒性,使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。目前,只能通过特异性的启动子在一定范围内调控ZFn的表达时间及表达量以减少脱靶切割,未来如何筛选更合适的启动子或者调控方式来降低脱靶切割是ZFn应用中应当克服的一个难题。
因子——TALE,该因子能特异性地结合DNA[33-34]。利用该特点,科学家们构建出另一种核酸酶TALEN,用于基因编辑。
TALE 核酸酶(TALEN) 是由TALE 代替了ZF作为DNA 结合域与FokI切割结构域连接成核酸酶。通过TALE识别特异的DNA 序列,FokI二聚化产生核酸内切酶活性,与ZFn一样在特异的靶DNA
[10,35]
。序列上产生双链断裂以实现精确的基因编辑
通过对目前发现的所有TALE蛋白分析发现,
TALE 蛋白中DNA 结合域有1个共同的特点,不同的TALE 蛋白的DNA 结合域是由数目不同的、高度保守的重复单元组成,每个重复单元含有33~35个氨基酸残基。这些重复单元的氨基酸组成相当保守,除了第12和13位氨基酸可变外,其他氨基酸都是相同的,这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基(repeat variable diresidues, RVD)。TALE特异识别DNA的机制在于每个重复序列的RVD可以特异识别DNA的4种碱基中的1种,目前发现的5 种RVD中,组氨酸-天冬氨酸特异识别碱基C;天冬酰胺-异亮氨酸识别碱基A;天冬酰胺-天冬酰胺识别碱基G或A;天冬酰胺-甘氨酸识别碱基T;天冬酰胺-丝氨酸可以识别A、T、G、C中的任一种。而通过对天然TALE的研究发现,TALE蛋白框架固定识别碱基T,所以靶序列总是以碱基T开始
[33-34,36]
(图2)。
因此,理论上可以根据实验目的对DNA结合域的重复序列进行设计,得到特异识别任意靶位点序列的TALE。2.2 TALEN的构建
TALEN在使用之前必须用特定方法构建特异性识别目标序列的TALE重复片段原件偶联结合结构域,由于其对于核苷酸的识别是一一对应的,所以构建和筛选相对于ZFn简单得多,目前有多种平台可以用于设计构建TALEN
质粒,不同的构建平
2 基因编辑技术的发展——TALEN
2.1 TALEN的结构及作用原理
ZFn的发明使得精确的基因组编辑成为可能,但是由于其对DNA序列识别的不规律性使得自身的发展受到局限。2009年,研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas) 中发现一种转录激活子样效应
2 TALE
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台使用的方式有所区别,但是其思路是一致的。TALEN的构建过程中,首先要完成TALE阵列的组装,使用PCR的方法获得每一个带有酶切位点接头的TALE分子,酶切连接使得单体的TALE分子组成阵列,最后将阵列连接进入含有TALEN C末端、N末端及FokI切割序列的质粒中完成一个TALEN质粒的构建。近3年来,TALEN技术飞速发展,已有很多商业化的TALEN构建试剂盒,也有很多生物技术公司提供TALEN构建的服务,使得TALEN的构建筛选更为高效和简便。2.3 TALEN的应用
TALEN的发明使基因组编辑的效率和可操作性得到了提高,对于目的片段的切割效率达到了近40%。目前,TALEN也像ZFn一样,被应用到了不同种的细胞及生物的基因组编辑中。
至今为止,研究者们已经应用TALENs对果蝇
[11]
TALEN的蛋白质相对分子质量要比ZFn大得多,过大的蛋白质分子往往会增加分子操作的难度,去除TALEN分子的不必要结构或者缩短识别序列的长度能一定程度地减轻影响,但是却有可能造成识别特异性降低而导致脱靶切割,引起细胞毒性。
3 基因组编辑技术的新方向——CRISPR/Cas9
3.1 CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理
TALEN对于靶序列识别的精确性使得该技术在近3年来得以飞速发展,但是其构建复杂,并且较大的相对分子质量在某些情况下使用困难也制约了其应用前景。最近,研究者们发现了一种RNA介导的DNA定点切割的方法可以用来进行基因组编辑。
规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs) 是一类独特的DNA直接重复序列,广泛存在于原核生物基因(大多数的细菌和几乎所有的古细菌)中[45]。自2002年首次被人们所定义以来[46],CRISPR一直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的共同关注。它的结构非常稳定,长度约25~50 bp的重复序列(repeats)被间区序列(spacers)间隔[47]。 2005年,Cas系统(CRISPR-associated sequences system, CASs)被发现在原核生物中表现出某种获得性免疫功能,能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力[48-49]。
CRISPR/Cas 系统的作用机制大体可分为3 个 Cas 蛋白在噬菌体侵入的起始阶段,不同阶段[49]:
复合物靶向裂解噬菌体基因组中短的原型间隔
这些原型间隔序列整合到宿主基因组中序列,
CRISPR 位点的5′端;然后这些短的掺入的间隔序列被转录成crRNAs;当宿主再被噬菌体感染时,crRNAs 作为模板通过Cas复合物靶向降解噬菌体DNA。
CRISPR系统大致分为3类,其中I型及III型CRISPR系统由复杂的Cas复合物介导DNA或RNA的降解,而在产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中发现的II型CRISPR系统组分较为简单,只需要crRNA与反式激活crRNA Cas9和两个非编码RNA :
(tracrRNA),3个组分即可介导外源DNA片段的靶
向降解,所以目前针对CRISPR/Cas9研究较多。在CRISPR/Cas9系统中,外源的DNA进入细胞内,细菌的RNaseIII催化crRNA的成熟,成熟的crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合,形成双链RNA结
、蛔虫[12]、斑马鱼[13]、青蛙[14]、大鼠[37]和
猪[38]等模式生物进行了基因组定点编辑。而使用TALEN技术对牛[38]、蟋蟀[34]和家蚕[39]等非模式生物进行内源基因的定点修饰也有报道。在目前的研究中,大多数研究者都使用一对TALENs对目标基因进行敲除,也有一些报道同时使用了两对TALEN对同一条染色体上的两个位点进行敲除,使基因组缺失更大的片段[40]。同样的,也已经有研究者利用TALEN和同源片段的引入实现了在斑马鱼和人的基因组中进行定点插入[41-44]。
在各种遗传疾病的治疗方面,TALEN技术的高精确性使得对这些错误基因的修饰比ZFn更具潜力。Mussolino等[43]利用TALEN和ZFn两个技术对人胚肺293细胞的CCR5及CCR2位点中19 bp的靶序列成功进行了定点敲除,且TALEN的脱靶切割几率比ZFn要低得多。Sun等[44]利用设计的一对TALEN和同源性序列成功地对缺陷型β珠蛋白基因进行了更改,使其恢复到正常序列。2.4 TALEN的优势和局限
相比ZFn技术,TALEN使用了TALE分子代替ZF作为人工核酸酶的识别结构域,极好地解决了ZF对于DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白与DNA碱基是一一对应的,并且对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定,这相对于ZFn的设计要简单得多。但是在构建过程中,TALE分子的模块组装和筛选过程比较繁杂,需要大量的测序工作,对于普通实验室的可操作性较低,而商业化公司构建也需要花费上千美元,使用成本较高;并且,
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构。这一crRNA: tracrRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA,在与crRNA引导序列互补的位点,Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链,而Cas9 RuvCI结构域剪切非互补链[50]。
3.2 CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的应用利用CRISPR/Cas9系统对DNA分子的靶向切割特性,使其可以被用于定向的基因修饰。2012年,来自加州大学伯克利分校的Doudna研究小组首先利用人工设计的crRNAs序列,使用产脓链球菌的CRISPR/Cas9系统对体外的DNA靶序列进行了精确切割,并且把crRNA:tracrRNA二元复合体改造为单链RNA嵌合体,也能同样指导Cas9蛋白在特
[51]
如果对Cas9蛋白定位点剪切双链DNA (图3);
的HNH核酸酶结构域及RuvCI 结构域进行修改,
CRISPR对靶位点的切割效率被证明与ZFn和TALEN相差无几,但是对不同序列的切割效率却存在着差别,不过其脱靶切割的几率相比前两种方法要低的多,然而,并没有任何一个研究小组提供了脱靶切割机率的具体数据。除了用于定点的基因
CRISPR/Cas9也可用于干扰目的基因的转录。编辑,
Qi 等[59]为改造构建了没有核酸切割活性的Cas9蛋白,通过与指导RNA转化大肠杆菌可以靶向干扰目的基因的转录,这一过程被称为CRISPRi。CRISPRi具有高度特异性,能够靶向干扰单个或同时干扰多个基因,而且通过可诱导启动子的加入,人为地控制干扰过程。他们利用CRISPRi系统干扰了大肠杆菌的乳糖调控途径中的不同分子,发现CRISPRi可以被用于探究信号通路上各个分子间相互作用。同样,CRISPRi系统在293细胞中也得以成功干扰目标基因的转录。
总而言之,CRISPR/Cas9应用于基因组编辑还处于初期阶段,但它的确为基因组编辑提供了一个新的思路,在将来的发展中具有极大的潜力。3.3 CRISPR/Cas9系统的优势和局限
相较于ZFn和TALEN两种人工核酸酶技术,CRISPR/Cas9系统是一个天然存在的原核生物RNA干扰系统,其介导的基因组编辑是由crRNA指导的,对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程,相比蛋白质对DNA序列的识别要精确更多,只要有一个碱基无法配对,就不会实现Cas9对DNA的切割,降低了脱靶切割的几率,减低了细胞毒性。而且CRISPR/Cas9的构建仅仅需要设计与靶序列互补的RNA即可,过程相对于TALEN更为简单和廉价,普通的实验室也可以自行完成构建,这大大提高了基因操作的效率及简便性。并且,CRISPR/Cas9系统是由RNA介导的DNA切割,若在RNA水平上进行分子操作,则可实现精确且瞬时的切割,在切割时间的调节上相较于ZFn和TALEN
容易得
还能完成对目标单链的切割 [51]。之后,又有报道分别证明了通过人为设计可以利用产脓链球菌的CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌细胞对外源噬菌体的双链DNA及外源质粒进行精确地定点切割[52-53]。2013年初,来自MIT的Zhang Feng研究小组 [54]证明了经过修饰的产脓链球菌Cas9蛋白可以在crRNA:tracrRNA的指导下对293FT细胞的特定位点进行精确地切割,他们同时发现对Cas9蛋白的RuvC I结构域进行修改之后, Cas9对目标基因进行单链的切割在人源细胞中同样可以实现。而且,CRISPR/Cas9系统可以通过设计多段crRNA来对同一个细胞的多个位点进行切割。该项研究甚至发现,把Cas9、crRNA及tracrRNA序列构建于同一个质粒上进行转染即可完成切割,大大降低了操作
[55]
的难度。来自哈佛的Church 研究小组同期的实验也利用了CRISPR方法对293T、K562以及iPS细胞进行了精确的基因编辑。之后又有3个不同的研究小组也利用了CRISPR/Cas9系统对人、小鼠和斑马鱼细胞同样进行了精确的基因组编辑
[55-58]
。
3 CRISPR/Cas9
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多。但是,CRISPR/Cas9系统在真核基因组编辑中也存在着一些不足。首先,Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠crRNA序列的匹配,在目标序列(protospacer)附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motifs, PAM),如果目标序列周围不存在PAM (目前证明PAM序列为NGG)或者无法严格配对,则Cas9蛋白不能行使核酸酶的功能,这也造成了利用CRISPR/Cas9不能对任意序列进行切割。其次,目前CRISPR/Cas9系统所靶向的序列仅需十余个碱基对精确配对,这可能降低CRISPR/Cas9系统切割的特异性。并且,作为一个原核的系统,针对真核细胞中染色体的各种修饰结构是否能够无差别地进行高效切割也需要进一步探究。最后,和ZFn及TALEN技术一样,CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题,这在将来的研究和应用中也亟待解决。
物转基因筛选优良品种或构建生物反应器等方面得到应用。总而言之,以上几种基因组编辑技术目前还处于研究的初期阶段,但其在基因操作方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景,将对医学和生物学产生深远的影响。
[参 考 文 献]
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4 展望
随着越来越多不同物种的基因组完成测序, 解读基因组的功能显得日益重要。基因组靶向修饰是进行基因组改造与基因功能研究的一个重要手段。ZFn技术首先为精确的基因打靶打开了大门,但是其对于DNA序列的识别特异性较低,容易造成脱靶切割引起细胞毒性,使得该技术在应用领域的发展受到限制。TALEN技术使用了转录激活子样效应物(TALE)代替了ZF作为DNA识别结构域,原理上能够一一对应不同的碱基而精确识别靶序列,克服了ZFn脱靶切割的问题,使得精确地基因组编辑技术得到一个推进,但是它仍然存在和ZFn一样构建复杂及使用成本高的问题。利用细菌和古细菌的获得性免疫系统CRISPR进行基因打靶是基因组编辑的一个新兴技术,该技术巧妙地利用了原核生物非编码RNA介导的DNA干扰来对目的序列进行精确切割,这种方法具有精确性高、系统构建简单和使用成本低、能同时对同一细胞多个位点进行切割等优势,但是这个技术的应用目前还处于细胞水平。并且,这一原核系统在面对真核系统复杂的染色体结构时,究竟能否有效切割,现在还不得而知。目前,以上3种方法的应用多是借助DNA的非同源末端连接,而利用DNA同源重组修复介导序列的插入、置换或修饰的成功案例则较少。在将来的发展中,如果能够提高同源重组的几率以实现高效率的定向基因修饰,则能够在遗传疾病治疗和动植
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