纤维素酶活测定
【实验目的】
1、 学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法
2、 巩固使用分光光度计
【实验材料】
1、3、5—二硝基水杨酸显色液;
2、0.5%羧甲基纤维素钠水溶液(CMC):用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置;
3、标准葡萄糖溶液(1mg/mL)。
【实验步骤】
1、标准曲线的绘制:分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至25ml。在550nm处比色。以光密度为纵坐标,以葡萄糖微克数为横坐标,绘出标准曲线(见表一)。
2、空白管的测定:取1毫升酶液,沸水浴5分钟,冷却加3毫升0.5%CMC,与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。
3、样品的测定:取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升,酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液,冷却加入3毫升显色液,再沸水浴10分钟,冷却后加水定容至25毫升,混匀,550nm测OD值(见表二)。
实验结果:见表一、表二:
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结果分析:拟合所得的标准曲线为:Y=7.439×10-4X-0.00243。拟合度为0.99917。由样品的A值,可得三份溶液的葡萄糖含量分别为:652.5ug,648.5ug,653.9ug。所以平均含量:651.6ug。
纤维素酶活力单位=651.6/0.01×30=2172 ug/mg×min
【思考与讨论】
1、在测定时为使各样品和空白管处理一致,应同时加入试剂,同时放入水浴中,同时取出水浴,以使反应得进行程度一致。
2、在测溶液的OD值之前,应将溶液摇匀,摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口,然后来回震荡试管。
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