流式细胞多色分选中的最大错误(上)

单身是一种选择，只不过不是我自己的选择。—— Pakalu Papito

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翻译整理 | 四正柏

多色分选是一个很复杂的过程，有很多相同的科学失误。

失败的多色分选会导致数据错误和结果无效。换句话说，成功的多色分选，可以得到很好的数据和得出强有力的结论。

成功的多色细胞分选需要很好的实验设计。给自己的实验设置特殊的策略可以为复杂的过程设计流水线式的合理系统。例如，多色分选实验中的重要步骤和方案可以节省时间和更好的阐释你的实验结果。

当设置多色实验时，最常见的错误是未能正确设置PMT电压，未能使用活性染料，无法正确识别粘连细胞，以及无法正确设定分选的区域和正确设门。所有流式实验都需要避免这四个错误，尤其是流式细胞分选实验。

接下来四个错误需要在分选前的设置前期避免，为了尽可能得到更好的细胞分选结果，这个设置需要被包含在设计、优化、预实验的过程中。

以下是需要注意的4个多色细胞分选常见错误：

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1. 不能正确地设置PMT电压

在设置多色实验时，最关键的步骤是正确设置PMT 电压。

实验设置的这一部分，与大多数的流式一样，需要最大信噪比。

因此，需要用未染色的空白组来设置电压调节阴性对照的峰到log象限的101的位置，不过往往不是这样的，电压调节的目的是每个通道取得最大的灵敏度。

记住在每一个单独的电压设置下PMTs不能最大化地展现（尽可能地把光源转为电源）。此外，为了确保检测器在峰呈现时工作，样品中必须含阳性和阴性的细胞群。

空白组只能观测到阴性细胞群，因此，不能确定染色的细胞群比未染的细胞群荧光信号好多少。

总而言之，如果电压设得太低，会导致干扰光信号产生和检测到干扰信号。

当在某个通道检测到待测细胞有自发荧光（如光谱的绿色区域），通过空白对照来设置电压，可能导致PMT电压太低。 相反地，红光通道中用空白对照设置电压，其中细胞自发荧光非常少，可能导致电压设置得过高，一旦需要所有荧光被检测，可能导致阳性细胞群超出了检测范围。

如果使用BD仪器用FACSDiva软件 (e.g. FACSAria, LSR II, LSR Fortessa) 通过CS&T质控微球系统会有助于检测电压的最小基线，或是在最小电压下检测器可以操作，优秀的文献提供了更广泛和更深入的方法达到相同的目的。

总的来说，有些有用的经验法则能帮助你选择最优的方法合理设置PMT电压。

首先，电压的设置要考虑所有的染色群都能被检测到，无论是从可视化角度还是从测量的角度看都是至关重要的（没有人喜欢看着染色超过检测范围）。 荧光强的部分可能不在检测器的线性范围内和可能不利于荧光检测。 这样只能通过跑一个有明确阳性细胞群的样本来完成。

通过补偿磁珠来设定电压要引起注意，染色可能非常亮，这可能导致将电压降低。检查后确保染色没有超出范围，调整电压，通常通过增加电压，把阳性和阴性细胞群最大化地区分开。

流式细胞术中的一个常见习惯是倾向于特意把补偿矩阵的百分比调至最小，以此来调整PMT设置。 记住，设置电压的主要目标是确保阳性和阴性之间的分群更明显。

重叠百分比不是对分离是否最大化的特别好的指示。

只要电压的设置能保证没有细胞群超出检测范围，检测器在线性范围中操作，并且阳性和阴性可以很好地分开，假设补偿被正确设置，不用担心补偿百分比。数据本身就可以证明。

始终确保每个对照组的PMT电压相同。 如果在所有通道中电压无法在对照组之间保持一致，那么补偿就不能被正确的计算。

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2. 没有正确使用活性染料

抗体趋向于与死细胞结合，会导致结果出现假阳性，很难得到比较好的纯度，对细胞分选来说这可能是毁灭性的，特别是当细胞将用于下游分子应用时。 此外，在以细胞为基础的检测实验中，包含了碎片的假阳性死细胞也无法生长，它们的存在可能影响其他细胞的生长进程。

有很多不错的细胞活性染料可供选择，它们基于有两种不同机制的：与DNA结合染料和胺反应性染料。

DNA结合染料，如碘化丙锭（PI），DAPI和7-AAD，是典型的不能通过完整细胞膜的具有较强DNA亲和力的带正电荷分子。 因此，它们只染死亡或细胞膜受损的将要死亡的细胞。这些染料是很好的选择，因为染色非常快，因此染料可以在分选之前才加入，而且不需要单独的染色步骤。

因为染色剂过量的存在于缓冲液中，DNA结合染料提供了细胞死亡的“实时”指示; 所以在分选期间死亡的细胞将允许染料进入细胞核并且将开始发荧光。

虽然不是分选经常要注意的，但是这些染料不能与固定的细胞一起使用，因为染料-DNA结合是非共价和平衡驱动的。

如果细胞在染色后固定，则在固定之前死亡的细胞中从DNA解离的染料可能对在固定之前存活的细胞的DNA染色，因为固定会破坏细胞膜完整性。 而胺反应性染料（通常称为“可固色”染料？）与细胞上和细胞中的游离胺共价结合。 用这些类型的染料染色必须在独立的染色步骤中进行。

染料将进入并染死亡或膜受损的细胞，因此死细胞的染色强度将远高于活细胞的染色强度，这样允许染料仅与细胞表面上的那些胺结合。 染色后，如果需要，可以固定细胞，因为染料 - 胺键是共价的而不是平衡驱动的，因此在固定后染色完整性能被保证。

通常，鉴于其易于使用和“实时”性质，在细胞分选实验上，DNA结合染料优于胺活性染料，因此在设计配色时可用的选择很多。

试剂生产商已经设计了许多不同的DNA结合活性，所以不难找到一个适合你的配色。由ThermoFisher生产的SYTOX?染料，是一个不错的选择。

比较好的是可以将活性染料与dump channel结合或与用于选出一个或多个阳性标志细胞的通道组合，例如从分析中除去“lineage-negative”细胞。 由于dump channe和活力染料通道都用于选出被染色的细胞，因此两者可以组合成一个通道，这可以节省出另一个通道用于另一个标记。

未完待续

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