微卫星不稳定性的生物学意义

・292・・综　　述・

微卫星不稳定性的生物学意义3及其应用前景

丁　一　童坦君(北京医科大学生物化学与分子生物学系,北京100083)

摘要　微卫星为遍布于人类基因组中的简单重复序列。在人群中,它们呈现高度多

态性,并且稳定遗传。微卫星的高度多态性是微卫星不稳定性的表现,它与错配修复

基因的缺陷有关。微卫星不稳定性已广泛应用于肿瘤学的研究,并依此提出了肿瘤

发生的“增变基因”途径。在遗传学、老年病学及其它一些生命科学,微卫星不稳定性

同样具有广泛的应用前景。

关键词　微卫星不稳定性;错配修复基因;增变基因

MicrosatelliteInstability:APotentialToolforthestudyofLifeSciences　DINGYi,

TONGTan2Jun(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BeijingMedi2

calUniversity,Beijing100083)

Abstract　Microsatellitesaresimplyrepeatednucleotidesequencesscatteredthroughout

thehumangenome.Theyarehighlypolymorphicamonghumanpopulationandinherit2

edinastablemanner.Themicrosatelliteinstability(MI)ishighlypolymorphic,which

isassociatedwiththedefectsinDNAmismatchrepairgenes.MIhasbeenwidelyused

byscientiststostudythetumorigenesis.Onthebasisoftheirfindings,a“mutatorthat

mutatestheothermutator”modelfortumorigenesishasbeenproposed.MIisalsoapo2

tentialtoolforthestudyofgenetics,agingandotherlifesciences.

Keywords　Microsatelliteinstability;Mismatchrepairgene;Mutator

微卫星(microsatellites)遍布于人类基因组中,在动物及部分微生物基因组中也有存在。它们是由同一脱氧寡核苷酸重复串联而成,重复顺序为1～6bp,重复次数不超过60次,片段长度通常小于350bp,在人群中表现出高度的个体特异性,并且稳定遗传。人类基因组中包含数万个微卫星位点,由于它们一般处于可积累中性突变的非编码DNA区域,在人群中呈现高度多态性。

微卫星多态性是微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MI)的表现。微卫星多态性表现于同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间,微卫星位点的重复单位的数目不同。微卫星多态性的检测采用PCR方法。选择位于微卫星序列两3　国家自然科学基金资助课题(39670806)

・293・侧的合适引物,对基因组DNA进行PCR扩增,将扩增产物以变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。对不同的标记引物,如荧光物质,同位素,生物素可分别采用不同的显示方法,不带标记的引物可以银染显色后观察结果。与正常组织相比较,若某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上,记为杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH);若等位基因条带增多和大小有改变则记为MI。传统的细胞遗传学核型分析检测LOH,将遗漏亚显微(submicroscopical)缺失,而微卫星标志物覆盖了许多基因组中的目的区域,克服了这个限制。MI的产生原因可能是

(strandslippage)现象。DNA复制过程中,当复制复合物复制一个DNA复制过程中的“链滑”

重复单位(repeatunit)后,子链与模板链分离,然后与下一个或下几个重复单位重新结合,使一

(loopedout)区域。正常情况下该结构可被错配修复系统(mis2个或几个重复单位形成”环凸”

matchrepairsystem)所校正,但校正系统失常时,子链DNA如继续延伸即可引起突变[1]。

错配修复基因超家族属于管家基因(housekeepinggenes),它们可查出并纠正DNA复制及DNA损伤过程中出现的未配或错配的碱基,控制复制和重组的精确性。该基因家族的突变将导致突变表型,表现为MI增加以及活性基因的高突变。研究资料表明,错配修复途径的不同缺陷可对各个微卫星家族有不同的影响。

目前已发现人类6个错配修复基因,其中3个为细菌MutS同源物,hMSH2、hMSH6(GTBP)和hMSH3;另外3个为细菌MutL同源物,hMLH1、hPMS1和hPMS2[2]。大肠杆菌

α,它是hMSH2和GTBP(G.T结合蛋错配识别蛋白MutS的人类同源物(homologs)为hMutS

白)的二聚物。二者之一的突变即难以识别G.T。大肠癌HCT15和MT1细胞系的GTBP突变失活,可引起体外单碱基错配和单核苷酸突环(loops)的选择性修复能力丧失,但不影响二核苷酸突环的修复。由此反映为HCT15和MT1出现单核苷酸MI,而不是双核苷酸的MI。hMSH2突变则不仅不能修复单碱基错配,而且不能修复单碱基突环和二碱基突环,在hMSH2有缺陷的细胞中的MI即包括单核苷酸也包括双核苷酸。人类细胞的大肠杆菌MutL蛋白同

α,是hMLH1和hPMS2的二聚体。其突变体出现相当多的单核苷酸和二核苷源物为hMutL

α涉及单核苷酸和双核苷酸的修复[1]。酸MI,提示hMutL

在单核苷酸和二核苷酸MI中,错配修复缺陷为重要原因,但错配修复途径在稳定较长重复顺序中起何作用还不清楚。hPMS2缺陷细胞系的三核苷酸重复顺序相当不稳定,如果这是hPMS2缺陷型细胞的特性,说明这个基因的产物为纠正三核苷酸重复位点复制错误所必需,由此说明错配修复也能校正三核苷酸重复区的复制错误。体外错配修复试验表明,二核苷酸、

α和hMutLα校正体系的底物;hMutLα和三核苷酸和四核苷酸的突环可作为依赖hMutS

α缺陷型细胞株的抽提物,其修复含有1～4个碱基重复序列突环的能力相当差。hMutS

GTBP突变体细胞系HCT115和MT1,在体外对二碱基、三碱基和四碱基突环的修复具相当效率,它们不显示三核苷酸MI[1]。hMLH1缺陷型细胞系HCT116,在体外不能修复含一个错配(或未配)及二个、三个、四个未配对碱基的DNA,但可修复含五、八和十六个未配对碱基的DNA,表明5个以上碱基突环的异源双链的修复与较小错配的修复有差别。hMSH2缺陷型大肠癌细胞系LoVo,即不能修复未配或错配一个碱基的DNA,也不能修复由2～5个碱基组成的DNA突环,表明突环异源双链的修复需要hMSH2,尽管LoVo细胞可能还有其它突环修复的缺陷[3]。有研究表明,hMSH3基因对2～4核苷酸重复的错配修复起重要的作用[4]。

一、MI在肿瘤研究中的应用

自1993年,MI应用于遗传性非息肉性结直肠癌(hereditorynon2polyposiscolorectalcan2

・294・cer,HNPCC)研究以来,MI已应用于胃癌、大肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤。HNPCC病人与几个错配修复基因的缺陷有关。Muta等研究了MI与大肠癌的关系,HNPCC高危组的MI为35%,确诊组MI为65%[5]。E2F4为E2F家族的一员,编码转录因子。E2F4外显子有13个CAG重复序列,在MI阳性大肠癌中可发生改变,17例高频MI位点的肿瘤中,11例具E2F4基因的突变。在这11例E2F4基因突变的大肠癌中,9例在hMSH3基因第7外显子的8个A重复具肿瘤特异性移码(frameshift)突变。再者,17例hMSH3突变肿瘤中12例具E2F4基因突变。可见E2F4基因与hMSH3基因突变之间明显相关。在具有MI表型的人类肿瘤中,E2F4基因的CAG重复顺序可能是缺陷型hMSH3蛋白的靶位点。CAG减少的E2F4基因的产物,丝氨酸区域较短,该区域可能为活性转录因子所必需。大肠癌的E2F4基因突变及其紧密关联的hMSH3的基因突变,产生突变型E2F4蛋白或可促进细胞的增殖[4]。

MI阳性胃癌中,凋亡相关基因BAX、hMSH3和hMSH6的移码突变率分别为64%、64%

βRII和IGFR基因的突变率在MI阳性胃癌中和52%,而MI阴性胃癌中无此类突变。TGF

分别为72%和8%。在MI阳性的大肠癌中,BAX、hMSH3和hMSH6的突变率分别为50%、

βRII和IGFR基因突变率分别为90%和20%。BAX、43%和29%。TGFhMSH3和hMSH6

βRII和IGFR突变率则在MI阳性大肠癌中较基因的突变率在MI阳性胃癌中稍高,而TGF

高。BAX的突变只出现在MI阳性胃癌中,但其它对肿瘤有抑制功能的基因无此现象,表明在胃癌的发生中,BAX基因突变具有重要意义[6]。王永信等研究了中国人胃癌组织在29个微卫星位点上平均MI频率为33.9%,胃癌的不同病理类型表现出不同的MI,低分化胃癌和印戒细胞癌与高分化癌比,MI频率明显增高[7]。

肿瘤发生是体细胞突变累积和克隆扩增的多步过程。微卫星位点的多样性(diversity)可以反映肿瘤中错配修复系统失活后细胞分裂的次数[8]。肿瘤发生有两条途径,即抑癌基因失活途径和增变基因(mutator)途径。在增变基因途径中,某些错配修复基因(初级增变基因)的缺陷和细胞增殖的共同作用,引起肿瘤基因组的不稳定性。由于次级增变基因,如hMSH3和hMSH6,含有初级增变基因作用的靶位点(微卫星位点),初级增变基因可选择性地作用于次级增变基因的上述位点,加速它们的突变。突变的次级增变基因使肿瘤细胞基因组不稳定性的深度和广度扩大,基因组不稳定性增高进一步加速了肿瘤发生过程中的癌基因突变的累积[9]

。

　　二、微卫星在衰老研究中的应用

衰老机制的研究有两条途径,其一是鉴定细胞老年期变化,确定这些变化不是单纯与老化相关,而是导致老化;其二是通过寻找引起生物衰老速率变更的突变体,找出调控衰老速率的

・295・基因[10]。在衰老机制研究中,微卫星目前仅应用于一些老年病的研究。血红素氧合酶2I(hemeoxygenase21,HO2I)是血红素分解代谢的一个关键酶,也是一种抗氧化酶。人类HO2I基因的启动子区域的一个微卫星位点呈高度多态性,尽管一些研究表明,HO2I可能涉及一些疾病如Alzheimer病(AD)和Parkinson病(PD)等,但研究结果表明,该位点虽与AD和PD相关,但不具独特的等位基因型[11]。此外,兼有载脂蛋白2E基因变异体APOE4,和α12抗糜蛋白

α酶(12antichymotrypsin,ACT)基因5’侧微卫星变异的个体,发生AD的风险显著提高[12]。Werner综合征的日本患者中,该综合征基因(WRN基因)有10种突变。其中突变4和突变6为主要突变,分别占126个不同染色体标本总数的50.8%和17.8%。WRN基因产物为类似于RecQ型DNA解旋酶的蛋白质。突变4位于WRN基因产物的羧基端,突变6基因产物为失去酶活性的掐了头(truncated)的酶蛋白。分析WRN基因周围的19个多态性位点,发现几乎所有的突变4纯合子病人具有的单倍体型是共同的,提示他们可能来自同一祖先,而该单倍体型在随机抽查的日本人中极其少见。意外的是,所有9个突变6纯合子病人与突变4病人有18个位点具相同的单倍体型,提示突变4和突变6皆可引起几乎相同的罕见单倍体型[13]。

三、微卫星在其它研究中的应用

由于微卫星的个体特异性,所以可用于个体鉴定。例如为确定肝移植后肝癌复发病例中癌细胞来源问题,如发现肝癌细胞的微卫星等位基因型与病人相同,不同于供体细胞,说明肝癌细胞来自于病人本身,而不是来自于供体。因而有人建议,将供体的一滴血保存数年,以供来日作为对照[14]。微卫星DNA在应用上的最成功的例子要数人类基因组高密度连锁图谱的完成。该图谱由5264个微卫星位点组成,覆盖3699个cM,平均间隔1.6cM。使用该图谱,大多数单基因疾病的连锁图谱可进行至cM水平,涉及人类疑难杂症疾病位点的基因组范围的搜寻也将受益于该图谱[15]。

有些人类遗传学疾病与MI有关。例如,有5种人类疾病是由于5个基因分别在其编码区CAG重复数目的增多而引起。这些疾病是X2连锁脊柱和延髓肌萎缩(X2linkedspinalandbulbarmuscularatrophy)、Huntington舞蹈病、脊髓与小脑运动失调2I型(type1spino2cerebellarataxia)、齿状核与苍白球萎缩症(dentatorubral2pallidoluysianatrophy)和Machado2Joseph综合征(Machado-Josephdisease)。正常人群中,CAG的重复数目为20,超过35～40将致病。40以上的重复数目可随后代增加到100,这样的病例将在幼年即可显现临床症状。非人灵长类不患这些疾病,这些灵长类在人类等位基因的相同位点虽具CAG重复,并具相似的重复数目多态性,但其重复数目小于正常人类。结果提示了CAG重复在进化中的扩增趋势[16]。人类的微卫星通常长于在黑猩猩的同源物,表明了种系进化中微卫星突变经常导致扩展(expan2sion)而不是收缩(contraction)[17]。对欧洲、非洲和亚洲的五个不同种群D21S11的多态性研究表明,所有样本分享相同的等位基因型,而非洲样本等位基因多样性最高。表明了现代人的非洲起源。较老的种群比年轻种群具更高的遗传多样性[18],这也是微卫星多样性作为分子肿瘤时钟(moleculartumorclock)的一个理论依据[8]。

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治疗Ⅰ型糖尿病的可能靶标

Ⅰ型糖尿病是一种自体免疫疾病,即身体的免疫系统进攻胰脏内生成胰岛素的β细胞。Yoon等人的研究表明,有一种叫GAD的蛋白质能独自引起这种进攻,这个发现在寻找Ⅰ型糖尿病治疗方法上迈出了一大步。他们用糖尿病小鼠模型进行实验,对小鼠进行基因工程改性,制造了一种β细胞不能生成GAD的家系。他们观察到免疫细胞不进攻这些没有GAD的β细胞,意味着如果能阻止人体的β细胞生成GAD的话,该法也许会开启一条治疗Ⅰ型糖尿病的

(Science,1999,284∶途径。1183～1187)(车　笛)