1实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染_顾伟鸣
临床检验杂志2010年7月第28卷第4期 Chi n J C li n L ab Sc , i J u l y 2010, V o. l 28, N o . 4
#271#
文章编号:1001-764X (2010) 04-271-02
#临床检验技术研究#
实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染
顾伟鸣, 杨阳, 吴磊, 莫小辉(上海市皮肤病性病医院检验科, 上海200050)
摘要:目的 评价实时荧光核酸恒温扩增技术(si m ultaneous a m plificati on and testing , S AT ) 检测沙眼衣原体(CT ) 核酸试剂盒(RNA 恒温扩增) 的敏感性和特异性。方法 对229例临床疑似患者的尿样及拭子标本同时进行S AT 检测和/金标准0沙眼衣原体细胞培养检测, 检测结果有差异的标本采用PCR 方法对拭子标本进行复测, 根据实验结果评估SAT 技术在尿样及拭子标本检测中的敏感性和特异性。结果 结合细胞培养和PCR 的实验结果作为/扩大金标准0, 得出SAT 技术对临床拭子标本的检测敏感性为97. 1%, 特异性为100%; 对尿样标本检测的敏感性为89. 4%, 特异性为99. 2%。拭子和尿样标本检测结果的符合率为95. 2%, 经卡方检验, 差异无显著性(V 2=3. 27, P >0. 05) 。结论 S AT 技术检测CT 试剂盒对拭子及尿样标本敏感性及特异性均较好, 适用于临床实验室对CT 的检测。
关键词:沙眼衣原体; 实时荧光核酸恒温扩增检测技术; 尿样检测中图分类号:R 374+. 1 文献标识码:A
绝大多数沙眼衣原体(Ch l a m yd ia tracho m atis , CT) 感染发生在16~24岁左右, 约70%女性、50%~60%男性的感染者无明显症状
[1-3]
收集首段尿样约1m , l 与1m l 样本保存液(SAT 试剂盒组分) 混匀, -20e 保存, 用于SAT 检测。1. 3 主要试剂及仪器 CT 核酸检测试剂盒(RNA 恒温扩增) (上海仁度公司); CT 核酸PCR 荧光检测试剂盒(深圳匹基公司); CT 培养用M c C oy 细胞系; NPA-32半自动核酸提取仪(杭州博日公司); 实时荧光扩增仪(B i o -Rad 公司i Q 5) 。
1. 4 实时荧光核酸恒温扩增(CT -SAT) 技术原理 同一温度下, 首先通过M-MLV 逆转录酶产生靶标核酸(RNA ) 的一个双链DNA 拷贝, 然后利用T7RNA 多聚酶从该DNA 拷贝上产生100~1000个RNA 拷贝; 每一个RNA 拷贝再从逆转录开始进入下一个扩增循环; 同时, 带有荧光标记的探针和这些RNA 拷贝特异结合, 产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获, 直观反映扩增循环情况。1. 5 CT 细胞培养检测 参见文献
[4]
。目前CT 检
测法都是以病人的泌尿生殖道分泌物作为检测标本, 容易增加病人的取样痛苦, 降低病人的检测意愿, 同时在敏感性和特异性以及报告时间上都有不足。我们于2008年3~6月, 采用以实时荧光核酸恒温扩增检测技术(si m u ltaneous a mp lificati o n and testi n g , SAT) 开发的C T 核酸检测试剂盒(RNA 恒温扩增), 对我院性病门诊疑似患者的拭子分泌物及尿样标本进行C T 检测, 并评估其敏感性和特异性。1 材料与方法
1. 1 标本来源 2008年3~6月来我院性病门诊就诊的疑似患者, 共计229例。分别采集相应分泌物和尿样标本(男性尿道拭子及尿样, 女性宫颈拭子及尿样) 。
1. 2 标本采集 采集标本前2h 内不排尿。用拭子采集分泌物:用特制无菌棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口采集分泌物标本, 采样后拭子在1. 5m l 生理盐水中洗涤。将该洗液震荡混匀后, 吸取1m l 至另一只装有1m l 样本保存液(SAT 试剂盒组分) 的标本冷冻保存管中, 并混匀; 上述标本均置于-20e 保存, 用于SAT 及PCR 检测。用于培养的标本采集B 将拭子采集的分泌物标本洗入1m l 衣原体运送培养基中, 用于衣原体培养实验。用于核酸检测的尿标本采集B 采集标本之前2h 内不排尿。
进行。
1. 6 样品检测 收集的一份拭子标本做细胞培养, 另外一份拭子标本、一份尿样标本进行SAT 检测实验, 分别获得拭子标本和尿样标本2个检测结果。若SAT 检测结果与细胞培养结果不符, 以及同一受检者的尿样与拭子SAT 结果不一致时, 均采用深圳匹基公司CT-PCR 试剂盒进行拭子标本的实时荧光PCR 检测。操作按试剂盒说明书进行。
1. 7 统计学分析 CT-SAT 对拭子标本和尿液标本检测结果的符合率分析采用V 检验, P
2
作者简介:顾伟鸣, 1962年生, 男, 副主任技师, 硕士, 从事性病传播疾病实验诊断研究, E-m ai:l w ei m i ng_gu2003@yahoo . co m. cn 。
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临床检验杂志2010年7月第28卷第4期 Ch i n J C li n L ab Sc, i July 2010, V o. l 28, N o . 4
2. 1 C T 细胞培养和CT-SAT 检测结果 229例疑似患者CT -SAT 检测拭子分泌物标本和尿样标本阳性率分别为44. 1%(101/229)和41. 0%(94/229),细胞培养法阳性率(拭子标本) 为38. 4%(88/229),见表1。
表1 沙眼衣原体细胞培养和CT-S AT 检测结果
CT 培养阳性
阴性
合计
CT -SAT (拭子) 阳性8615101
阴性2126128
CT-SAT(尿样) 阳性831194
阴性5130135
术, 能够对病人泌尿生殖道分泌物及尿样标本进行CT 的检测。与PCR 方法相比, 该方法只检测病原体RNA, 因活菌中才有完整的RNA 片段, 故能排除患者治疗后病灶处残留的衣原体DNA 对检测结果的影响
[5-6]
。另外, 尿样作为一种非侵入性的取样标
本, 也很有临床应用价值。
本次试验研究中, CT-SAT 实验结果阳性、而CT 细胞培养结果阴性的标本可能是细胞培养敏感性不足造成的, 这部分标本经PCR 实验后得到验证。对于CT-SAT 在少部分拭子标本及尿样标本检测中的结果差异, 我们分析可能是由于CT 为细胞内寄生物, 尿样中的CT 含量较低或存在扩增抑制物等因素有关。对于2例细胞培养阳性, CT -SAT 和PCR 扩增检测均为阴性的标本, 我们推测可能存在以下情况:待测标本保存不当, 导致核酸(DNA 或RNA ) 的丢失; 标本中存在核酸扩增抑制物; 衣原体特异性核酸序列的突变4 参考文献
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In t J STD
[7]
2. 2 实时荧光PC R 检测结果 229例受检者中有22例受检者的C T-S AT 拭子和尿样结果与细胞培养结果有差异, 按照实验设计对这22例受检者留存的生理盐水标本(拭子来源) 进行PCR 检测, 结果见表2。
表2 CT 细胞培养和CT-SAT 结果不一致标本的PCR 结果
PCR 合计
阳性阴性
细胞培养阳性325
阴性16117
CT-SAT(拭子) 阳性18018
阴性134
。有待进一步研究。
2. 3 CT -SAT 检测的敏感性及特异性 以细胞培养结果为参比, 对结果有差异的样品, 补充结合PCR 结果为/扩大金标准0, 得出S AT 技术对临床拭子标本的检测灵敏度为97. 1%(101/104),特异性为100%(125/125);对尿样标本的检测灵敏度为89. 4%(93/104),特异性为99. 2%(124/125)。结果见表3。
表3 CT-S AT 检测结果与/扩大金标准0的比较
/扩大金标准0阳性
阴性
合计
CT -SAT(拭子) 阳性1010
101
阴性3125128
CT-SAT(尿样) 阳性93194
阴性11124135
2. 4 CT -SAT 法对拭子标本和尿液标本检测结果的符合率分析 CT-SAT 法对229例受检者的拭子标本和尿样标本进行检测, 2组标本检测结果的符合率为95. 2%(218/229),经卡方检验, 差异无显著性(V =3. 27, P >0. 05) 。3 讨论
SAT 是建立在RNA 恒温扩增技术和实时荧光检测技术基础上的第二代核酸检测技术。本次试验采用的CT -SAT 检测试剂盒应用磁珠法核酸提取技
2
tracho m atis [J].JM icrob iolM et hods , 2009, 78(1):101-103.
(收稿日期:2009-08-20, 修回日期:2010-03-08)
(本文编辑:陈维忠)