实验一分子生物学实验室的常规仪器设备及有关操作

实验一 分子生物学实验室的常规仪器设备及有关操作

【实验目的】

（1）了解实验的常规仪器、设备、耗材。

（2）掌握本实验所用仪器的功能和使用方法。

【实验内容】

一、验室的常规仪器、设备

(一) 温度控制系统：

1. 冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱，最

常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。

4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。

-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。 -80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。 0-10℃的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。

2．液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长

期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。

3．培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养。

，用来维 CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%）

持培养液的酸度（pH值）。

37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。

4. 水浴锅：用于保温。

25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。 25-100℃水浴箱用于常规试验。

5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面

的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。

（二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。

1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。 多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质，不能完全除去水中溶解的气体杂质

。 （Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mo(Ⅵ)）

2. 离子交换器：去离子水—用离子交换法制取的水，称去离子水。

去离子效果好，但不能除去水中的非离子型杂质，其中常含有微量的有机物（树脂等）。

3．超纯水：用蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环。用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。

（三）菌消毒设备：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。。

1．蒸汽消毒锅：用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消

毒且定时进行消毒

2. 紫外线：75%乙醇 、0.1%SDS（消毒剂）

一些耐高压、高温消毒且可用紫外线照射或乙醇和SDS浸泡。

紫外线照射使用方便，且很方便，但灭菌效果与距离有关，且产生臭氧污染安

全，用于无菌室，超净台和塑料用具的消毒。

3. 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。

4. 煮沸消毒：主用于金属器械和针急需时采用。

（四） 计量系统：

1. 称量系统：（各种天平）台秤、托盘天平、钮力摆动天平、

光电分子天平、精密电子分析天平

2. 液体体积的度量：精：量筒、移液管、微量取液器

粗：刻度试管、烧杯、锥形瓶

3. pH值测量：

pH计：测定溶液中H+的直接电位的仪器，主要通过一对电极，在不同的pH溶液中产生

不同的电动势用pH值表示出来。

pH试纸：只适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。而

大部分试剂的配制要求严格的pH值，需精确度高（小数点后两位）的pH计。

4. OD值测量：光密度、分光光度计是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来

鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、

测量仪表或显示屏幕所组成。OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通

过所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行核酸溶液

定量和纯度的初步判断。

（五）离心机：离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。因为各

种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异，可利用强大的离心力场，使其

分离、纯化和浓缩。目前有各种各样的离心机。可供少于0.05ml到几升的样品

离心之用。离心技术应用广泛，包括收集和分离细胞、细胞器和生物大分子等。

据其转速的不同，可分为以下几种类型：

1. 普通离心机：最大转速6000 r/m ，最大离心力6000g

①医用或台式离心机：是离心机中最简单而廉价的，最常用于收集快速沉降系数的

物质，如红细胞、粗大的沉淀物、酵母菌和细菌等。

②低速冷冻离心机：主要用于细胞、细胞核、细胞膜和细菌的沉淀和收集等。

2. 高速离心机：最大转速25000 r/m ，最大离心力89000g

有冷冻和常温两种，多用于制备和手收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、

硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。

3. 超速离心机：最大转速9000 r/m ，最大离心力694000g。

4. 台式超速离心机：最大转速12000r/m ，最大离心力625000g。

（六）超净工作台：内有紫外灯、照明灯、还应有酒精灯火焰、75%乙醇等灭菌的设备，是

一种提供局部洁净度的设备。其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器

后，通过工作台面，使实验操作区域成为无菌的环境。超净台按气流方向的不同

大致有几种类型：

①侧流式：净化后气流，从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，或者从上往下或

从下往上流向对侧，他们都能形成气流屏障而保障台面无菌。

缺点：在净化气流和外边气体交界处，可因气体的流向而出现负压，使少量的未

净化气体混入，而造成污染。

②外流式：气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面气体不能混入。

缺点：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部分

遮挡起来，使气流往下方流出。

（七）电泳系统：电泳技术是检测、鉴定各种生物大分子的纯度、含量及描述它们的特征，

甚至还是分离、纯化、回收和浓缩样品的工具之一。核酸和蛋白质等都带有电荷，

当它们被置于电场中时，能够移动。

电泳装置由两部分组成：电源装置和电泳槽装置。

① 电泳装置：电源需经稳流通过稳压器，既能提供稳定的直流电，又能输出稳定

的电压。可用于三种：

常度稳压电泳仪：输出电压0-500v 0-15mA

中度稳压电泳仪：输出电压400-1000v

高度稳压电泳仪：输出电压1000以上的电源装置。

② 电泳槽装置：分两种

水平式电泳槽：一般分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽

垂直式电泳槽：分垂直平板电泳槽和圆柱形电泳槽装置。

（八）PCR仪：Polymerase Chain Reaction仪，也称DNA热循环仪，基因扩增，它是使一

对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数百万

倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行的DNA变性，引

物复性，DNA聚合酶催化的延伸反应三个过程。

（九）凝胶成像分析系统:

对电泳后含溴乙锭（EB）核酸样品的观察分析。

（十）干燥设备：

1. 真空加热干燥箱：核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定，用于杂交实验。

2. 电泳凝胶干燥箱：电泳后的凝胶进行脱水干燥的仪器，一般可将凝胶干燥到一些玻璃纸上，干燥后的凝胶易于保存。

3. 液氮冷冻干燥：适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。

4. 真空泵：许多实验都需要抽真空。如：乙醇沉淀后核酸样品的干燥，电泳凝胶的干

燥等。

（十一） 其他

1. 微波炉：便于一些溶液的快速加热和定温加热，电泳琼脂糖凝胶配制、溶化等。

2. 制冰机：用于制造大多数核酸、蛋白质的实验操作所需的低温环境，以减少核酸酶

或蛋白质酶的水解。

3. 层析装置：（色谱分离）是一种分离多组分混合物的有效物理方法。

真空印记系统，DNA合成/测序仪：这些都是对核酸进行深入研究的必备仪器。

4. 磁力搅拌器：多角度旋转混匀器、快速振荡混合器：用于混合仪器。

5. 组织匀浆器：超声组织及细胞破碎器，用其进行样品的分离提纯实验。

6. 通风橱：很多溶剂能逸出毒气，必备柜 ，放射性试验还要有有机玻璃屏蔽。

7. 玻璃蒸馏器、电热加帽、变压器：用于酚等有机溶剂的蒸馏。

8. Tip头、Eppendorf管：

微管移液器tip头（吸液尖）、Eppendorf管（微量离心管）可洗涤，硅化消毒后

反复使用。对一些要求严格的实验，如RNA的提取、保存等操作，应使用新的消

毒tip头与Eppendorf管。另外还应备有常用规格的离心管（1000ml、500 ml、250 ml、50 ml、7 ml等）及96孔、24孔、12孔、6孔的细胞培养塑料平板等。

9. 小型设备、用具：

定时器、滤膜、保鲜膜、防护眼镜鸭嘴镊、常规的玻璃或塑料器皿（包括平皿、

试管、烧杯、量瓶、试剂分液漏斗、避光保存的试剂应使用棕色试剂瓶，如饱和

酚、巯基乙醇等）、记号笔、各种手套PE、乳胶、家用、防酸的等）

二、本期实验所用主要仪器、 设备的功能及操作

1. 酚的重蒸馏装置：空气冷凝式玻璃蒸馏器。

一般酚是无色透明的结晶，如呈粉色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，如醌、二酸等，变色的酚不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。使用前必须在160℃-180℃重蒸馏以去除能引起RNA和DNA断裂和交联的污染杂质，从而得到纯净的酚。

2. 磁力搅拌器：81-2型恒温磁力搅拌器

将导电温度表用导线与二芯插头连接，插入后面的温度表孔内，当温度上升到预先调整好的度数时即自动停止加热（控温搅拌）。主要用于物质的快速搅拌、溶解和混匀。如配制试剂，制备酚的水饱和液等。

3. 蒸馏水器：1810B自动双重纯水蒸馏器，石英管加热式，本器的一次及二次蒸馏均有保

护装置，使用安全可靠，热继电器当冷却水突然中断或缺水的情况下，即自动切断电源。干簧继电器控制二次蒸馏瓶内的水位，其高度应以在水位降低时能自动切断电源为准，从而达到自动控制水位的目的。

该仪器主要用于制备双蒸水和三蒸水。

4. 离心机：TGL-16G台式高速离心机，最大转速20000rpm，主要用于核酸提取时蛋白质

的沉淀和有机相与水相的分层，PCR检测的瞬时离心。

5. 微量取液器：主要用于精确量取微量液体体积和核酸水相的转移。

6. 匀浆器：5ml、10ml玻璃匀浆器。

主用于组织细胞的破碎。

7. 凝胶成像分析系统

主用于核酸样品琼脂糖凝胶和PCR电泳结果的紫外观察和照像。

8. PCR仪：PTC-200基因扩增仪

体外扩增核酸的仪器

9. 蒸汽消毒锅：用于实验用试剂、器皿、用具等的灭菌清毒

有电加热式、电炉加热式两种。

10. 超净台：JJT-1300型洁净工作台，侧流式。

原理：吸进气经过初、中级过滤皿（无纺布滤过）后，再通过风机经高级过滤器（超细玻璃纤维滤纸制成）而形成洁净空气。主要是在局部空气造成洁净空气环境，以使工作区域中的悬浮粒子及微生物控制在最低限度内。

本台操作压为垂直层流压，因此出风面与操作位置不应放置多余的物品，以免妨碍气流的正常流动，影响洁净度，台面板上的孔作为通风孔，使用时避免有液体或其他物品漏入空中，以免影响内部构件。风速可调。

使用：75%乙醇消毒2-3次，摆放好实验用品。插上电源，紫外消毒30分钟，启动风

机5m后关灯，关灯后10分钟打开照明灯，即可使用。

11. 电泳系统：

①电泳仪：HV-3000型高度三恒多用电泳仪（恒压、恒流、恒功率）

②电泳槽：水平式两种。

12．微波炉：主要用于琼脂糖的快速溶解。

【小测验】

1.可调式微量取液器的使用方法？使用该取液器的注意事项？

2.分子生物学实验室的常规仪器设备有哪几大类？简单说明。

3.蒸馏水与去离子水的区别？PCR技术需要哪种纯度的水？

实验二 动物组织块DNA的提取

【实验目的】

（1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。

（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。

【实验原理】

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

【仪器、材料、试剂】

（一）仪器

1．高速离心机

2．烘箱

3．冰箱

4．水浴锅

5．微量移液器

6．高压灭菌锅

（二）材料

1．生理盐水

2．十二烷基硫酸钠（SDS）

3．三羟甲基氨基甲烷（Tris）

4．乙二胺四乙酸（EDTA）

5．饱和酚

6．氯仿

7．异戊醇

8．无水乙醇

9．75%乙醇

10．蛋白酶K

11．RNase酶

12．手术剪刀、镊子、吸水纸

13．微量取液器

14．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔

（三）试剂配制

1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml

配制方法：

40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转

移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2．生理盐水: 0.85%NaCL 100ml

配制方法：

在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准

备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml

配制方法：

将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加

入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐

步加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES缓冲液（释放DNA） 100ml

配制方法：

将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、

0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴

上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

5．10% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml

配制方法：

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓

HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。

6．蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。

7．RNA酶 （降解RNA）

配制方法：

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL

中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存

于–20℃。

8．氯仿：异戊醇=24：1 100ml

按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保

存备用。

9．TE缓冲液（溶解DNA） PH8.0 50ml

配制方法：

将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到

50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，

高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

【实验步骤】

1．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎。

2．加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56˚C保温4-6h，每2h摇1次。

3．放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。

4．加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。

5．加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。

6．加入2.5倍体积的-20˚C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。

7．12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。

8．-20˚C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55˚C干燥DNA。

9．加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20˚C保存备用。

【注意事项】

1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

3．乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

实验三 植物基因组DNA提取

【实验目的】

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

【实验原理】

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

【仪器、材料、试剂】

(一) 仪器

1．高速离心机

2．烘箱

3．冰箱

4．水浴锅

5. 高压灭菌锅

（二）材料

1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)

2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）

3．乙二胺四乙酸（EDTA）

4. 氯化钠

5．2-巯基乙醇

6. 无水乙醇

7. 氯仿

8. 异戊醇

（三）试剂

1. CTAB抽提缓冲溶液: 250ml

配制方法：称取CTAB 4g，放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入100

ml的三蒸水，加热溶解，再依次假如56 ml的5mol\l NaCl、20 ml 的1 mol\l Tris-HCl 20ml( PH8.0)、8ml 的0.5 mol/l EDTA定容至250 ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温, 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇（400ul），4℃保存。

2. 氯仿:异戊醇=24：1（配制方法如实验二）

3．TE缓冲液: PH8.0（配制方法如实验二）

【实验步骤】

(一) DNA的提取

1. 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；

2. 取少量叶片置于试管中，用小杵磨至粉状；

3. 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；

4. 置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

5. 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管，振荡2~3 min，使两者混合均匀；

6. 10000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

7. 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将

离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

8. 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出

9. 加入800 µl 75%的乙醇，将DNA洗涤 30 min；

10. 10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

11. 加入50 µl 0.5 × TE缓冲液，使DNA溶解；

12. 置于-20℃保存、备用。

【注意事项】

1. 叶片磨得越细越好。

2. 注意移液器的正确使用。

3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性

外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

实验四 核酸的电泳与检测

【实验目的】

（1）了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理，学会其具体的操作程序。 （2）对提取的DNA进行检测，掌握紫外电泳图谱的观察分析方法。

【实验原理】

琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。带电荷的物质在电场中的定向运动称为电泳，核酸分子是两性解离分子，在pH8.0时，DNA分子带负电荷在电场中向正极移动。采用琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，长度不同的DNA分子由于受凝胶阻遏作用大小不一，迁移速度不同，从而达到有效分离DNA的目的。

【仪器、材料、试剂】

（一）仪器

1．电泳装置：电泳仪、水平电泳槽、梳子、制胶槽 2．紫外观察：凝胶成像系统 3．高速离心机 （二）材料 1．琼脂糖

2．三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3．硼酸

4．乙二胺四乙酸（EDTA） 5．溴酚蓝 6．蔗糖

7．溴化乙锭（EB） 8．DNA Marker（λDNA）

9．称量纸、容量瓶、瓷盘、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒（100mL）、Tip头（10uL）、胶带

（三）试剂配制

1．5×TBE（pH8.0）（电泳缓冲液） 1000 ml

配制方法：

称取Tris 54g、硼酸 27.5 g，再加入20ml的0.5mol/LEDTA加三蒸水定容至 1000ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2．凝胶加样缓冲液（6×）（指示剂） 100 ml

称取溴酚蓝0.25 g、蔗糖40 g然后加入三蒸水定容至100ml摇匀后，4℃保存备用。

【实验步骤】

（一）、制胶

1．称取0.4g（适量）琼脂糖置于三角瓶中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液。 2．微波炉加热，煮沸、振摇，反复加热、振摇2-3次，使琼脂糖充分融化。 3．胶带将胶床两端粘好，底部粘严，以防凝胶渗漏，插好梳子。

4．待胶冷却至60℃左右时，将融化的琼脂糖小心地倒入胶床中，速度要快，让

胶自然冷却至完全凝固（约需要20-30分钟）。

5． 小心向上方拔出梳子，避免前后左右摇晃，以防破坏胶面及加样孔，去掉制胶槽

两边的胶带，小心将胶和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。 6． 向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，液面高于胶面约1-2mm。

（二）、上样电泳

1、取2µl上样液（溴酚蓝指示剂）于Parafilm上，加2µl水与2µl样品DNA反复吹吸，混匀。

2、Tip头垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中。

3、接通电源，打开高压开关，电泳开始以正、负极铂金丝有气泡出现为准。 4、根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 5、凝胶取出后于含EB的溶液中染色20分钟。

（三）、凝胶紫外观察：

染色后的凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。

【注意事项】

1. 琼脂糖融化时，档位不宜太高。 2. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。

3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。

4. 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或 DNA带型不整齐。

5. 电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。

6. 电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。 负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。

7． 溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA

呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。

实验五 PCR扩增目的基因片段

【实验目的】

通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。

【实验原理】

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向

DNA合成。基本原理及过程如下：

PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1． 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2． 退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3． 延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

【仪器、材料、试剂】

(一) 仪器材料

1． PCR热循环仪 2． 电泳凝胶成像系统 3． 高速离心机 4． Tip头、离心管 (二) 试剂

1．DNA摸板（自己提取DNA） 2．4种dNTP 3. 引物1、引物2 4. Taq酶 5. 琼脂糖

6. DNA相对分子量标准物

7. 三蒸水

【实验步骤】

（一）PCR反应混合液的配制：反应体系25 µL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序

加样：

1．按下列次序加入下列各组成分： 反应物

体积/µL

终浓度

ddH2O 17.3 10 x Buffer 25 mmol/L MgCl210 mmol/L dNTP

2.5 2.0 0.5

1 x 2.0 m mol/L 0.2m mol/L

10 µM上游引物 1 0.4 µmol/L 10 µM下游引物 1 0.4 µmol/L DNA Taq聚合酶 0.2 1 U

2. 用手指轻弹管底，使溶液混匀

3. 高速离心机瞬时离心，使溶液集中于管底 (二) PCR循环程序

按下述程序进行扩增:

94℃ 预变性 3min 94℃ 变性

30s 50℃ 退火 40s 72℃ 延伸 1min

72℃ 充分延伸 5min

（三）PCR扩增结果的检测 1．配制1.0% 琼脂糖凝胶 2．4µl PCR产物上样 3．5-8V/cm的电压电泳 4．电泳结束后，EB染色20min 5．凝胶成像系统观察拍照分析结果

40cycle

【注意事项】

1. 隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头。 2. 加样完成后要瞬时离心，保证样品沉于管底。 3. 加样顺序合理化，避免交叉污染。

实验六 总DNA的纯化和定量

【实验目的】

对提取的总DNA进行去RNA和杂蛋白纯化，并学会DNA的定量分析.

【实验原理】

用RNase去除RNA，酚、氯仿反复抽提的方法，去掉DNA中混入的杂质，得到

一定纯度的总DNA。

【仪器、材料、试剂】 （一）仪器

1．高速离心机 2．恒温水浴锅 3．微量取液器 (二) 材料

1．饱和酚 2．氯仿 3．异戊醇 4．无水乙醇 5．75%乙醇 6．RNase酶

7．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔 （三）试剂

1．氯仿：异戊醇=24：1（配制方法如实验二） 2．TE缓冲液（溶解DNA）（配制方法如实验二） 3．5×TBE（pH8.0）（电泳缓冲液）（配制方法如实验四） 4．RNA酶（去除RNA）（配制方法如实验二）

【实验步骤】

（一）DNA的纯化

1．向提取的总DNA中加入TE至100µl,再加1µl的RNase A，于37℃温浴1h。 2．加100µl酚：氯仿：异戊醇，颠倒混匀，大约10min。 3．10000r/m，离心10分钟，取上清液。

4．加100µl氯仿：异戊醇, 颠倒混匀，大约10min；10000r/m，离心10分钟，取上清液。 5．加250µl的无水乙醇，沉淀DNA。12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。 6．加300µl 70%乙醇洗涤DNA，10000 r/m，离心5分钟,弃乙醇。

7．55℃，10-20min干燥DNA。

8．加适量的TE溶解DNA，与-20℃保存。

（二）DNA的定量和检测

1．制备0.8%的琼脂糖凝胶

2．取8µl入DNA于Parafilm上，加入µl水，充分混匀，成A液 3．从A液吸取8µl，加入8µl水混匀，成B液 4．依次类推，制作4个浓度梯度的入DNA混合液

5．样品DNA，2µl上样电泳

6．凝胶紫外观察，估计DNA的浓度。

（三）分光光度计定量

1．DNA样品的稀释

2．测定OD260、OD280和OD230的光密度值。

3．根据OD260计算DNA浓度；计算OD260/OD280值，估计DNA的纯度。

【注意事项】

1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。 2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。 3．乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

实验七 核酸的限制性内切酶降解

【实验目的】

(1) 了解限制性内切酶的各种特性及影响因素。 (2) 学习设计酶切体系并对总DNA进行酶切。

【实验原理】

限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内部或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。共有三种类型，经常使用的为II型限制性内切酶。酶单位规定为：在最适合反应条件下1h完全降解1ug λDNA的酶量。

【仪器、材料、试剂】

(一) 仪器

1. 恒温水浴锅 2. 微量移液器 3. 高速离心机 4. 电子天平 5. 微波炉 6. 电泳仪 7. 电泳槽 8. 凝胶成像系统 9．微量移液器 （二）材料 1．琼脂糖

2．三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3．硼酸

4．乙二胺四乙酸（EDTA） 5．溴酚蓝 6．蔗糖

7．溴化乙锭（EB） 8．HindⅢ 9．酶切Marker 10. 入DNA

11. 称量纸、容量瓶、瓷盘、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒（100mL）、Tip头（10uL）、

胶带

（三）试剂

1．5×TBE（pH8.0）（电泳缓冲液）（配制方法如实验四） 2．凝胶加样缓冲液（6×）（指示剂）（配制方法如实验四）

3．溴化乙锭：（染色剂） 0.5ug/ml

【实验步骤】

1．酶切体系的建立

按下列顺序依次加入各成份于0.5mL的离心管中：

反应物

体积/µL

终浓度

H2O 10µl 10×Buffer 2µl 1

入DNA 3µl 3.75ng/µl

HindⅢ 5µl 2.5µmol/L

弹匀，防止气泡产生，短暂离心。

2．酶切反应，水浴锅中37℃，温育5h. 3．电泳检测

（1）制胶 1%琼脂糖凝胶.

（2）点样 分别吸取10µl的酶切产物，与2µl上样液充分混匀，点样。

酶切标准品取3µl上样。

（3）电泳 100V的电压，电泳大约20min（依据溴酚蓝迁移的位置决定是否停止电泳）。 （4）荧光染色 将电泳后的琼脂糖凝胶放入含0.5ug/mLEB的溶液中染色20min。 (5) 凝胶成像系统紫外观察、拍照分析。

【注意事项】

1．隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头。 2．加样完成后要瞬时离心，保证样品沉于管底。 3．加样顺序合理化，避免交叉污染。

实验八 感受态大肠杆菌的制备及转化

【实验目的】

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

【实验原理】

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的

重组子导入细菌的过程。细菌处于0°C，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA 附着于细胞表面，经42°C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在 非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Ap+得到表达，然后子。将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化。

【仪器、材料、试剂】

(一) 仪器

1． 超净工作台 2． 分光光度计 3． 高速冷冻离心机 4． 台式离心机 5． 恒温摇床 6． 生化培养箱 7． 电热恒温水浴锅 8． -70℃冰箱 9． 恒温箱 （二） 材料

1． 大肠杆菌DH5α菌株: 2． 质粒pUC19 3． 胰蛋白胨 4． 酵母提取物 5． 氯化钠（NaCl）’ 6． 氨苄青霉素 7． 氯化钙（CaCl2） 8． 501mL离心管

9． 吸头、小指管 、试管、培养皿、锥形瓶 (三) 试剂

1. 0.1mol/L CaCl2溶液 2. 液体培养基

配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；摇动容器至溶质完全溶解，用NaOH调节至pH7.0，加去离子水至1L，灭菌备用。 3. 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/L溶液,置-20°C冰箱保存。

【实验步骤】

(一) 感受态细菌的制备：

1. 用接种环从E.coli DH5α菌平板上挑取一单克隆菌落，接种于装有2ml LB液体培养基

的试管中中，37℃ 220 rpm振荡培养过夜（12～16h）。

2. 取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中中，37℃，220 rpm振荡培

养2-3h，隔20-30min测量OD600值.( 此时OD≦0.4~0.5，细胞数务必＜108/Ml,此实验成功的关键。

3. 无菌条件下将菌液转至1.5ml 离心管中，冰上放置10min。 4.

4℃，6000 rpm，离心10 min，以回收细胞。

5. 倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量培养液流尽。每管加10ml冰

预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min 。 6. 4℃，6000 rpm，10 min,回收细胞。

7. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2,2ml重新悬浮细胞（重悬时操作要轻）， 8. 分装细胞，每200µl一份此细胞为感受态细胞。 (二) 细菌转化:

1. 取200ul新鲜配置的感受态细胞,加入DNA2µl混匀，冰上放置30min，本实验使用

pUC19受体菌对照组：200µl感受态细胞+2µl无菌ddH2O；质粒DNA对照组：200ul 0.1mol/L CaCl2+2µl pUC19

使细胞膜产生通道，便于DNA2．将管放入42℃水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用，

分子的吸附进入，提高转化率。 3．迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。

4．每管加600µlLB液体培养基，37℃，培养1h。（慢摇）

5．将适当体积200ul已转化的感受态细胞，涂在含Ampicillin的LB培养皿中。 6．倒置平皿37℃培养12~16h，出现菌落。

【注意事项】

1．实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。

2．实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3．必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。 4．整个实验过程均需置于冰上。

5．选用对数生长期细胞，OD600不应高于0.6。

实验九 质粒DNA的提取

【实验目的】

（1）了解质粒DNA提取的原理

(2 ) 掌握一步法从大肠杆菌中提取质粒DNA的方法

【实验原理】

质粒是一种双链共价闭合环状DNA分子，它是染色体外能稳定遗传的因子，具复制和控制的结构，是寄生性自主复制子。将细菌液体培养物用酚/氯仿混合，同时完成裂解和蛋白质变性的两个过程，经离心去除核DNA与蛋白质，含质粒的上清液用异丙醇沉淀。

【仪器、材料、试剂】

(一) 仪器

1. 高速离心机

2. 漩涡振荡器

3. 恒温摇床

4. 电子天平

5. 微波炉

6. 电泳仪

7. 电泳槽

8. 凝胶成像系统

9．微量移液器

（二）材料

1．细菌液体培养物

2．饱和酚

3．氯仿

4．异戊醇

5．无水乙醇

6．琼脂糖

7．三羟甲基氨基甲烷（Tris）

8．硼酸

9. 乙二胺四乙酸（EDTA）

10. 溴酚蓝

11. 蔗糖

12. 溴化乙锭（EB）

13. 称量纸、容量瓶、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒（100mL）、Tip头（10uL）、胶带

(三) 试剂

1．液体培养基

配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g

酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g

NaCl 10g

摇动容器至溶质完全溶解，用NaOH调节至Ph=7.0 ,加入去离子水至总体积为1L,121°C

湿热灭菌20min。

【实验步骤】

（一）质粒DNA 的提取

1. 取0.5mL过夜培养的菌液，于1.5mLEP管中

2. 加入0.5mL酚：（25：24：1）于漩涡振荡器振荡1min，充分混匀

3. 12000rpm离心5min，取上清0.45mL左右，于另一新EP管中

4. 加入0.5mL异丙醇，混匀，马上12000rpm离心5min

5. 加入70%乙醇漂洗沉淀，离心，，可再漂洗1次，12000rpm离心1min

6. 弃上清，加0.3mL70%乙醇漂洗；

7. 弃上清，于55℃干燥DNA

8.加入适量TE液，溶解DNA，-20℃保存备用

（二）质粒DNA 的电泳检测

1. 制胶 1%琼脂糖凝胶.

2. 点样 分别吸取5uL的质粒DNA，与2uL上样液充分混匀，点样。

3. 电泳 100V的电压，电泳大约20min（依据溴酚蓝迁移的位置决定是否停止电泳）。

4. 荧光染色 将电泳后的琼脂糖凝胶放入含0.5ug/mLEB的溶液中染色20min.

5. 凝胶成像系统紫外观察、拍照分析

【注意事项】

1. 酚具腐蚀性，用时要小心，避免溅在皮肤、衣服上。

2. 乙醇漂洗力度柔和，不可用力振摇。

3. 离心时，一定先平衡离心管，注意转速逐渐上升。

任 竹 梅