嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长特性与培养条件研究_任香芸

第17卷第2期:65生　物　技　术Vol . 17, No . 2:65

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2007年4月BIOTECHNOLOGY Apr . 2007

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嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长特性与培养条件研究

任香芸

1, 2

(1. 福州大学生物科学与工程学院, 福建福州350002; 2. 福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建福州350013)

摘要:目的:研究嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的生长特性与培养条件。方法:以菌体生长量为主要评价指标, 利用单因子试验与正交试验相结合的方法对影响CHB1生长的主要因素进行分析。结果:CHB1最低和最高生长温度分别为45℃和74℃,最佳培养温度为60℃;最低和最高起始生长pH 值分别为6. 5和9. 0, 最适起始pH 为8. 0; 菌体生长到达对数期的时间为15～18h ; 接

9

种量2%,装液量40mL , 转速180r min 。结论:CHB1为高温菌, 生长pH 范围偏碱性, 条件优化后总菌体浓度可达1. 1×10CFU mL 。

关键词:嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1; 生长特性; 培养条件

中图分类号:Q939. 9　　文献标识码:A 　　文章编号:1004-311X (2007) 02-0065-04

, 陈济琛, 蔡海松, 林新坚, 邱宏端

2221＊

Study on the Growth Characteristics and Culture Conditions

of Geobacillus stearothermophilus CHB 1

RE N Xiang -yun

1, 2

(1. College of Biological Science and Technology , Fuzhou Univers ity , Fuz hou 35002, China ; 2. The Soil and Fertilizer Institute , Fuj ian Academy of Agricultural Science , Fuz hou 350013, China )

, CHE N Ji -chen , CAI Hai -song , LI N Xin -jian , QIU Hong -duan

2221＊

A bstract :Objective :To stud y the growth characteristics and culture conditions of Geo bacillus s tearo ther mophilus CHB1. Metho ds :Using cell den -sity as the main index , by sin gle factor analysis and orthogonal experiment to study the main factors that influence on CHB1. Results :The lowest ,

highest and optimal temperature for the growth of G eob acillus stearo ther mophilu s C HB1were 45℃,74℃and 60℃respectively . With regard to the initial p H value for the cell growth , the lower , upper limitation and the optimal pH were 6. 5, 9. 0and 8. 0respectivel y . It reached logarithmic phase at 15-18h , 2%for inoculum percent , and 40ml for bottling volume , 180r min for rotate speed . Conclusion :C HB1was Thermophiles ,

9

which had a alkaline pH value range . The biomass could be reached 1. 1×10CFU mL . Key words :G eo bacillus stearo ther mophilus CHB1; growth characteristics ; culture condition 　　基于微生态理论的不断发展和完善, 微生态制剂在畜牧业及其废弃物处理中已得到广泛应用, 并起到一定的效果。迄今为止, 有关堆肥化处理的研究主要集中在堆肥工艺条件、影响因素等应用效果方面[1-3], 而对堆肥中功能菌株的筛选鉴定, 菌株的发酵生产、最适培养条件、作用机理及菌种最佳组合等基础理论研究相对较少[4, 5]。系统深入地研究微生态制剂中各种微生物的生理生化特性, 优化发酵条件, 实现高密度培养, 不仅可以降低成本, 提高产率; 还可以促进微生态制剂的商品化进程, 为其推广普及奠定基础。

高温菌是具有极其重要科学价值和应用价值的生物资[6]

源。由于耐高温的特性, 高温菌产生的酶具有较高的热稳定性和反应效率[7], 较常温菌具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率, 在固体废弃物的堆肥化处理等环保领域有着广阔的应用前景和科学价值。目前国内关于高温菌用于有机固体废弃物堆肥处理的研究开展的比较少[8]。嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1(G eob acillus stearo ther mophilu s C HB1) , 为作者所在实验室从鸡舍旁边土壤中分离得到并经中科院微生物所鉴定, 初步研究表明该菌为高温菌, 具有较全的酶系, 在有机固体废弃物的堆肥化处理中能有效促进堆肥温度, 缩短腐熟时间, 因而是研制有机物料促腐剂的良好菌种。目前有关嗜热脂肪土芽孢杆菌的研究, 多集中于酶的利用等分子生物学方面[9-12], 对其生长特性与培养条件的研究很少有报道[13]。作

收稿日期:2006-11-28; 修回日期:2006-12-13基金项目:福建省发改委项目资助作者简介:任香芸(1980-) , 女, 硕士生, 从事微生物遗传育种研究, E -mail :xiangyun09@126. com ; ＊通讯作者:邱宏端(1955-) , 女, 教授, 从事应用微生物研究, E -mail :@163. 。

者在前期试验中对CHB1种子发酵培养基进行了筛选和优化,

菌量比在基础发酵培养基中提高10倍以上。本文在此研究基础上对CHB1的生长特性及培养条件进行了研究, 旨在进一步提高CHB1的生长量, 为此菌在堆肥化处理及其它方面的应用提供基础依据。

1材料与方法

1. 1　材料1. 1. 1　菌种来源:嗜热脂肪土芽孢杆菌C HB1(G eobacillus stearothermo philus CHB1) , 由福建省农业科学院土壤与肥料研究所微生物室筛选保存。1. 1. 2　培养基1. 1. 2. 1　活化培养基:牛肉膏0. 3%,蔗糖0. 2%,大豆蛋白胨1. 0%,NaCl 0. 2%,琼脂2%,p H 7. 5。1. 1. 2. 2　平板计数培养基:牛肉膏0. 5%,蔗糖0. 5%,大豆蛋白胨0. 5%,蛋白胨0. 5%,NaCl 0. 2%,琼脂2%,pH 7. 5。1. 1. 2. 3　种子发酵培养基:牛肉膏0. 5%,大豆蛋白胨0. 9%,NaCl 0. 2%,K 2HPO 40. 1%,KH 2PO 40. 075%,p H 7. 5。1. 2　方法1. 2. 1　菌体生长情况判定

在相同培养条件下观察各处理中菌落的有无、多少、菌落大小、菌落饱满程度, 定性判定培养条件对菌体生长的影响, 确定菌体生长pH 、温度等的大致范围。1. 2. 2　菌体浓度测定1. 2. 2. 1　活菌计数法[14]

取1mL 发酵液加入到9mL 无菌水中, 依次做10倍系列稀释, 选取三个适当的稀释倍数, 吸取1mL 稀释液注入培养皿中, 做三个平行培养皿60℃恒中

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第17卷第2期66

培养18h , 选取菌落数在30～300之间的培养皿计菌落数。1. 2. 2. 2　吸光度法

取5mL 培养液, 以未培养的培养基作为空白对照, 测定其在波长620nm 处的吸光值。1. 2. 3　菌悬液的制备

将CHB1在活化培养基中培养18h , 按照1管菌 10mL 无菌水的比例将斜面菌体洗入无菌水中, 摇匀, 制成一定浓度的菌悬液, 备用。1. 2. 4　生长温度试验[15]

最低和最高生长温度测定:将CHB1菌悬液作适当稀释后, 涂布于活化培养基平板上, 分别置不同温度下恒温培养24h , 每个温度设三个重复, 观察菌体生长情况。

最适生长温度测定:用250mL 三角瓶, 每瓶装50mL 种子发酵培养基, 接种5mL C HB1菌悬液, 分别于不同温度下180r min 摇床振荡培养24h , 测定培养液的菌体生长量, 依据生长量的大小确定最适生长温度。1. 2. 5　初始pH 值试验

CHB1最低和最高生长pH 试验:将CHB1菌悬液作适当稀释后, 涂布于不同初始pH 的活化培养基平板上, 于最适温度下培养24h , 每个梯度设3个重复, 观察菌体生长情况。

最适起始生长pH 试验:用250mL 三角瓶, 每瓶装50mL 不同p H 种子发酵培养基, 接种5mL CHB1菌悬液, 于58℃、180r min 摇床振荡培养24h , 测定培养液的菌体生长量, 依据生长量的大小确定最适初始生长pH 值。1. 2. 6　接种量试验

将C HB1菌悬液以不同体积份数接入盛有50mL 种子发酵培养基的250mL 三角瓶中, 于58℃、180r min 摇床振荡培养24h 后测菌量, 确定接种量的大小。1. 2. 7　通气量试验

摇床转速的选择:将CHB1菌悬液以2%接种到盛有50mL 、pH 8. 0种子发酵培养基250ml 三角瓶中, 分别于不同转速下, 恒温培养24h , 以菌量为指标, 确定转速大小。

装液量的选择:在250mL 三角瓶中分别装入不等量的p H 8. 0种子发酵培养基, 以2%接种量接种, 于58℃、180r min 摇床振荡培养24h , 测定菌量。1. 2. 8　培养时间试验

斜面种子最佳培养时间的确定[16]:取一环CHB1划线接种于活化培养基斜面上, 最适温度下培养, 每隔一段时间取样观察菌苔及进行镜检。

CHB1生长曲线的测定[17]:将C HB1菌悬液以2%接种到pH 8. 0种子发酵培养基中, 于58℃、180r min 摇床振荡培养, 每隔3h 取样, 测定OD 620值及p H 值, 以时间为横坐标, OD 620值和pH 值为纵坐标作图。

Fairl y good growth ; “+++”Very good growth .

图1　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的最适生长温度Fig . 1　The opti mal temperature for Ge obac illus stear other mophilus CHB1growth

2. 2　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的生长pH

由表2看出, pH 值过高或过低都不适宜菌株的生长。CHB1最低起始生长pH 值为7. 0, 最高起始生长pH 值为9. 0, pH 值范围偏碱性。从最适生长p H 试验曲线(图2) 看出, 初始pH 值小于8. 0时, 随pH 值的升高菌量逐渐增大; pH 值为8. 0

8-1

时菌数最多达2. 71×10(CFU ·mL ) , 后随pH 值的升高, 菌量迅速下降。表明CHB1的最佳起始生长pH 值为8. 0。

表2　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的最低和最高起始生长pH 值Tab . 2　The lowes t and highest initial pH for Ge obacillus st ear ot her mophilus CHB1growth pH 值pH value 生长情况Gro wth conditions

6. 5-7. 0+-7. 5+

8. 0++

8. 5++

9. 0+-9. 5-

　　注:“-”表示不生长; “+-”表示生长很差; “+”表示生长一般;

“++”表示生长良好。Note :“-”No growth ; “+-”Poor growth ; “+”General gro wth ; “++”Fine growth .

2　结果与分析

2. 1　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的生长温度

温度是影响微生物生长的最重要的因素之一。从表1和图1可以看出, CHB1最低生长温度为45℃,最高生长温度为74℃。其最适生长温度为55～60℃。表明CHB1的生长温度范围较宽, 且能够耐受70℃以上的温度, 属高温菌。

表1　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的最低和最高生长温度Tab . 1　The l owest and highest temperature for Ge obacillus s tearothe rmophilus CHB1growth 温度(℃) Temperature (℃) 生长情况Growth conditions

45+-50+

55

60

65

70

74+-78-

图2　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的最适初始生长pH 值Fig . 2　The optimal initial pH for G eobacillus s tearothe rmophilus CHB1growth

+++++++++

　　注:“-”表示不生长; “+-”表示生长很差; “+”表示生长一般; ”

++”表示生长较好; “+++”表示生长很好。

“”

2. 3　接种量对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长的影响

由图3可见, 接种量的大小明显影响延滞期的长短及菌体细胞生长量。接种量在2%～10%时, 细胞数量相当; 而接种量进一步增大, 其生长量反而呈大幅度下降趋势, 可能原因是CHB1为好氧型, 接种量增加的同时, 增大了发酵液的体积而减少氧量, 从而影响了CHB1的生长, 表明接种量为2%较合适。2. 4　通气量对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长的影响

从图4与图5可以看出, 在一定范围内, 摇床转速越大或装液量越小, 菌量就越大, 说明CHB1对O 2有较高的要求, 增大转速或减小装液量都可以增加溶氧量; 由两图还可知, 转速过大或装量过小, 菌量都有下降趋势, 提示该菌的生长对氧气, 180r min , 。

2007年4月　　　　　　　　　　　　　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长特性与培养条件研究　　　　　　　　　　　67　　2. 5　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1

生长特性

利用其中的氮源产胺类物质[18]; 以及菌体衰亡后发生自溶而

使pH 值上升。

表3　不同生长时期嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的形态Tab . 3　The morphology of Ge obac illus stear other mophilus CHB1at different growth period

培养时间(h )

菌体形态M orphology of CHB1

Ti me (h )

1418202836

图3　接种量对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长量的影响

Fig . 3　Effect of inocul um percent on Ge obacill us s tearothe rmophilus CHB1bio -

mass

48

菌苔薄而均匀, 镜检菌体杆状, 均匀, 个体较小菌苔均匀, 镜检菌体杆状, 均匀菌苔均匀, 镜检菌体杆状,

不均匀, 极少数菌体一端膨大发亮形成极少芽孢

菌苔均匀, 光滑, 菌体杆状, 部分形成芽孢, 端生菌苔均匀, 镜检菌体形成大量端生芽孢

图6　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长曲线Fig . 6　Growth curve of Ge obac ill us ste ar other mophilus CHB1

图4　摇床转速对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长量的影响

Fig . 4　Effect of shaker ' s rotating speed on Ge obac ill us s tearothe rmophilus CHB1biomass

2. 6　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1培养条件的正交试验优化

在单因素试验基础上对CHB1菌株进行培养条件的正交优化试验, 选择对菌体生长影响较大的温度、p H 值、接种量和溶氧量作为考察对象, 以菌体生长量为指标, 用L 12(31×24) 型

[19]

正交表进行正交试验。结果得出, 各影响因素的主次顺序为:温度>接种量>p H >溶氧条件; 方差分析表明, 温度对其生长的影响达较显著水平, 其它各因素影响较小; 四因素的最佳组合为:接种量2%,温度60℃,p H 8. 0, 摇瓶装量40mL , 与单因素试验结果大致相同, 故不作详细描述。

3　讨论

3. 1　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1在基础发酵培养基与嗜热脂肪芽孢杆菌培养基[22]中生长较差, 菌量仅有106～107CFU mL , 通过前期培养基的筛选及本试验生长条件研究, 菌量提高了10～100倍, 最高菌体浓度可达到1. 1×109CFU mL , 这对CHB1菌株的大规模生产提供了基础依据。但由于试验条件所限, 其它影响菌体生长的因素如转速等未进行优化, 所以各培养条件之间不一定为最佳搭配, 这可能对菌体最大生长量有一定的影响, 需进行重复试验验证。3. 2　结合前期耐高温菌的筛选、产酶特性研究、培养基的筛选及本试验CHB1培养条件的研究, 可以更好的阐释菌体在堆肥中的作用机理, 并有助于CHB1的工业化生产。较何琳燕、林仁哲[20, 21]等单纯研究微生物菌群在堆肥中的作用效果有了更深入的探讨。3. 3　在Geo bacillus stearothermo philus CHB1的鉴定结果中, 其生理生化特性与嗜热脂肪芽孢杆菌非常相似; 本文对CHB1生长特性研究表明, 该菌耐受温度较嗜热脂肪芽孢杆菌高[8], 可达74℃,为高温菌; 培养基成分方面, CHB1对碳、氮源的要求也明显不同于嗜热脂肪芽孢杆菌[22], 因此可以初步判定CHB1与嗜热脂肪芽孢杆菌应是不同的菌株, 有关两菌株的区分有图5　摇瓶装量对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长量的影响Fig . 5　Effect of liquid volume on G eobacillus stear other mophilus CHB1bio mass

2. 5. 1　斜面培养菌体生长特性

作为斜面种子, 应达到个体均匀, 形态一致, 健壮而无芽孢, 且有一定密度。对CHB1在斜面培养过程的生长特性进行观察, 结果如表3, 培养18～20h 的斜面种子较符合上述条件, 适宜用作液体培养的菌种。菌体培养到28h 开始形成芽孢, 至48h 形成大量芽孢, 提示可以作为菌体保存的菌种。2. 5. 2　嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长曲线

对CHB1进行液体培养, 检测其生长曲线与pH 变化, 结果如图6, CHB1在开始的一段时间里生长迅速, 15～18h 达到对数生长期; 之后为稳定期, 一直持续到第27h , 后菌数下降。从生长过程中菌液p H 值的变化来看, 0～6h p H 值不断下降, 可能是开始生长阶段菌体分解碳源产生大量酸性物质的缘故;

, C HB1,

第17卷第2期:68生　物　技　术Vol . 17, No . 2:68

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2007年4月BIOTECHNOLOGY Apr . 2007

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(1. 沈阳军区疾病预防控制中心, 辽宁沈阳110034; 2. 沈阳药科大学中医, 辽宁沈阳110016)

摘要:目的:为了从环境中分离透明颤菌(V itreo scilla ) , 对培养基和生长条件进行了优化。方法:采用富集培养的方法, 对透明颤菌生长的培养基成份进行了筛选试验。结果:在培养温度为32±2℃,50ml 500ml 三角瓶, pH 7. 8, 醋酸钠浓度为0. 02%,摇床转速120r min 条件下, 透明颤菌生长最佳培养基是:酵母粉0. 7%,蛋白胨0. 3%。结论:透明颤菌在上述培养基中生长12h 可达到高峰。

关键词:透明颤菌; 培养基; 富集培养; 优化

中图分类号:S476　　文献标识码:A 　　文章编号:1004-311X (2007) 02-0068-02

王洪军, 尹旭辉, 杨姝明, 孙艳, 吴益民, 张志强, 冯立, 杨国平

1

培养基对透明颤菌生长的影响

1

2

2

1

1

11

The Influence on Culture Media to V itreoscilla

1

1

2

2

W ANG Hong -jun , YIN Xu -hui , YANG Shu -ming , SUN Yan , WU Yi -min ,

111

ZHANG Zhi -qiang , FE NG Li , YANG Guo -ping

1

(1. Centre of Disease Prevent and Control of Shenyang Command , Shenyang 110034, China ;

2. School of Traditional Chines e Materia M edica , Shenyang Phar maceutical Universit y , Shenyang 110016, China )

A bstract :Objective :In order to isolate V itr eo scilla from environ ment , culture media and growin g condition was optimized . Methods :method of

cumulation cultivation was used and culture media ingredient was screened with regard to V itr eo scilla . Results :The optimu m growth conditions for Vitreos cilla was in medium of yeast 0. 7%,tryptone 0. 3%,NaAc 0. 02%,p H7. 8and 32±2℃,50ml 500ml culture flask , in a shaker incuba -tor set at 120r min . Conclusion :When culture media is as aforementioned same , V itreo scilla reached peak after growth 12h . Key words :V itreoscilla ; culture media ; cumulation cultivation ; optimization 　　透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性菌, 通常生长在泥潭、沼泽地中, 在贫氧的环境下能够加强合成透明颤菌血红蛋白(V itr eoscilla Hemoglobin , VHb ) 。由于VHb 直接作用于与氧有关的代谢途径, 在氧受限条件下碳流分配选择线粒体的乙醛歧化途径, 从而促进细胞生长[1]。利用VHb 在发酵菌株中表达, 能够有效地解决需氧微生物发酵过程中的供氧问题, 因此, 优化选择适宜透明颤菌生长的培养基是分离获得透明颤菌的前提条件, 本研究分离培养了透明颤菌, 并对培养基进行了优化, 利用VHb 在发酵菌株中表达, 对有效地解决好氧微生物发酵过程中的供氧问题具有重要的科学意义, 有关透明颤菌培养基的优化研究尚未见相关报道。

1. 1. 2　试剂:乙酸钠、丙酮、二亚硫酸钠、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉等试剂均购自上海生物工程技术有限公司, 均为化学分析纯。1. 1. 3　仪器:日本olympus 公司生产的CX21FS1型普通显微镜, 日本三洋公司生产的恒温培养箱, 惠普上海分析仪器有限公司生产的7320分光光度计, 上海医用分析仪器厂生产的台式离心机。1. 2　方法1. 2. 1　标本的来源及其处理:根据透明颤菌的生长习性, 选取奶牛场、河道、静湖、菜场垃圾箱和雨后存水形成的凹地作为采集点, 同一类采集地点选取多处。对于牛粪原则上应选取新鲜的[2], 但在实际中常常由于条件的限制, 并为做对照考虑, 要采集几天前或更远一些的牛粪; 河水、湖水和雨后存水在收集时要把底部污泥搅动起来与水体一并收集[3]; 生活垃圾要选择菜场内数日未处理的含腐烂蔬菜的糜质, 本试验采用甘蓝及韭菜, 置于敞口容器内数天使其腐烂变质。每次采集标本几十克(ml ) 放于事先灭菌的容器内。1. 2. 2　筛选透明颤菌所用的培养基:选择PYA 培养基,(蛋白胨0. 4%,酵母粉0. 6%,乙酸钠0. 02%) 对其进行筛选。固体1, 高压灭菌后, 铺。10g

1　材料与方法

1. 1　材料1. 1. 1　菌株:从自然界的多种来源采集标本, 分离获得菌株。

收稿日期:2006-12-25; 修回日期:2007-01-22基金项目:辽宁省教育厅青年人才基金项目资助(No . 05L433) 作者简介:王洪军(1956-) , 女, 吉林人, 博士, 副研究员, 从事生物化