一般有两条路
定量PCR一般有两条路，一条是探针，另一条是染料。因染料是普遍适用的，无需特异设计，费用也相对低廉，故用者更多。定量PCR中的染料通常是SYBR Green I，但它也并非完美。SYBR Green I对PCR有抑制作用，在实验中的使用浓度很低，且与富含GC的序列优先结合。因此，后续的熔解分析只能判断PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增，而不适合HRM分析。
于是，研究人员也在不断尝试新品，来替代SYBR Green I。南澳大利亚大学药学和医学院的高级讲师Paul Monis在定量PCR中一直使用SYTO 9。他谈到：“我早在2000年就开始使用SYTO 9。它比SYBR Green更好。它不会引起PCR抑制，对DNA熔解曲线分析更佳。我们也评估了一些新染料，但它们都不及SYTO 9。”
2005年，Monis等还发表了一篇比较SYBR Green I与SYTO 9的文章，认为后者对PCR的抑制更少，且产生了重复性更高的DNA熔解曲线1。然而，市场上绝大多数定量PCR试剂盒所使用的染料仍是SYBR Green。人们似乎一时还难以转变。丹麦的另一个研究小组也找到了SYBR Green的替代品SYTO 82和SYTO 13 。它们不会抑制PCR，也不会与富含GC的序列优先结合，即使在高浓度下也不影响熔解温度。此外，SYTO 82的检测极限要低50倍。
看了这些研究结果，您或许也想试试新的染料。以上的SYTO系列都来自Invitrogen旗下的Molecular Probes品牌。SYTO 82和SYTO 13都为250 μl（5 mM），2725元。相比之下，SYTO 9的价格较贵，100 μl（5 mM）为2772元。
此外，Bio-Rad公司也推出了一款新的qPCR试剂，其中使用了EvaGreen染料，作为SYBR
2010年6月13日第七十七期
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Green的替代。据Bio-Rad公司的产品经理Viresh Patel介绍，EvaGreen是第三代的双链DNA结合染料，与SYBR Green相比有几个优势。它对PCR的抑制更少，能在饱和条件下使用，产生更亮的荧光信号。既然是饱和染料，也就与HRM分析兼容。Bio-Rad将EvaGreen与Sso7d融合聚合酶以及优化的缓冲液组合，形成了新一代的SsoFast ，在qPCR应用中表现更佳。
近些年，定量PCR正朝着通量越来越高、反应体积越来越小、速度越来越快这个方向努力，相信新试剂、新仪器的不断涌现，会帮助我们走得更远。
参考文献：
1 Monis PT, et al. "Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis." Anal Biochem, 340: 24 – 34, 2005.
2 Gudnason H et al. "Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature. Nucleic Acids Res. 35: e127, 2007.