成骨细胞体外培养研究进展
第２８卷第４期
山东中医药大学学报
ｖ０１．２８，Ｎｏ．４
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・综述・
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成骨细胞体外培养研究进展
徐展望，许波，李军
（山东中医药大学附属医院，山东济南２５００１１）
［关键词］成骨细胞；体外培养；中药［中图分类号］Ｒ６８
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１００７—６５９ｘ（２００４）０４—０３１３—０３
成骨细胞起源于间充质的骨祖细胞或称前成骨细胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）。骨祖细胞大致可分为两
植入大鼠体内，最终形成带血管蒂的小梁骨。张超等１１０＇１ｌＪ用胶原酶短时预消化法从取自新西兰兔胫骨上端内侧面骨膜上短时间内得到高纯度的成骨细胞。从研究中可知，来源于骨膜的细胞具有很强的传代繁殖和定向分化为成骨细胞的能力。１．３骨髓
骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质。骨髓基质含有能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞的前体细胞群，称为骨髓基质细胞（ｍａｒｒｏｗ
ｓｔｏＨｎａｌｃｅＵ
类：定向骨祖细胞（ｄｅｔｅｍｉｎｅｄ
ｏＳｔ∞ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ，
ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ
ＤＯＰＣ）和可诱导骨祖细胞（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
ｃｅｌｌ，ＩＯＰＣ）。在生理状态下ＤＯＰＣ为成骨细胞的主要来源，在骨折、脱钙骨基质修复骨缺损等病理状态下，ＩＯＰＣ也有很重要的作用。目前培养成功的成骨细胞大多起源于Ｄ（）ＰＣ。现就成骨细胞的研究进展作一介绍。１成骨细胞的来源
１．１
ＭＳＣＳ）或间充质干细胞，
这类细胞具有强的增殖能力和多分化潜能。
韩君等ｕ２Ｊ分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养，用Ｄｅｘ、ＡＡ、Ｂ—ＧＰ作骨诱导剂，证实可向成骨细胞转化，表现为ＡＬＰ活性增高和形成钙化沉积。张银刚等ｕ３Ｊ采用胎兔长管骨骨髓细胞进行体外培养，证明其有骨细胞系特性，可作为修复骨缺损的种子细胞。Ｌｏｃｋｌｉｎ等【１４Ｊ研究证明，地塞米松和转化生长因子（ＴＧＦ）抑制骨髓基质细胞增殖但提高ＡＬＰ活性，表明二者可导向成骨细胞转化。金丹等ｌ”】在实验中观察到ｂＦＧＦ可促进骨髓基质细胞的增殖，ｖｉｔＣ可促进其分化。骨髓基质细胞有取材方便、机体损伤小、易于临床应用的特点，适于用作骨组织工程细胞的来源。
２成骨细胞的体外分离及培养方法的研究进展
许永华等【１６Ｊ取兔双侧胫骨骨膜，分别采用原法分离细胞及新法分离细胞，即先用０．１％胶原酶消化１ｈ（３７℃）离心后，再用０．１％ＥＤ，ｒＡ与０．２５％胰蛋白酶等量混合液消化３ｍｉｎ，低速离心收集细胞后接种。结果表明，原分离法对成骨细胞破坏程
３１３
骨
国内外文献报道动物（大鼠、小鼠、鸡、兔）、人的胚胎颅骨或新生动物的颅骨为成骨细胞的常用来源。近有学者尝试用去卵巢山羊的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、活性及发生钙化的功能ｕ，２ｊ。最近又建立了用成熟大鼠的颅骨及生长期的大鼠的长骨分离培养成骨细胞的方法。王海彬等【３￣５Ｊ取人松质骨建立成骨细胞体外培养模型并得到了大量纯化的成骨细胞。黄洁等【６，７Ｊ选用成年雌性大鼠松质骨在较短的时间内得到较多数量的成骨细胞。１．２骨外膜
Ｖａｃａｎｔｉ等例１９９３年从新生小牛肩胛骨骨膜中分离出成骨细胞并种植到多孔聚羟乙酸支架上，７～
１０
ｄ后成骨细胞发生增殖；又于１９９４年【９Ｊ从胎牛
肱骨骨膜上分离出成骨细胞种植到聚合物支架上并
［收稿日期］２００４．３—１２
［作者简介］徐展望（１９６０一），男，山东济南人，副教授，研究方向：骨与关节损伤的临床研究。
万方数据
２００４年７月
山东中医药大学学报第２８卷第４期
度大，培养成活率仅为１２．５％，而新分离方法对成骨细胞破坏甚微，培养存活率可达到８７．５％。丁焕文等［１７，１８］参照Ｉｓｈａｕｇ和Ｌｉｂｅｒｒｎａｎ的方法并加以改进，用含０．１％的胶原酶、０．０５％胰蛋白酶、５僦ｌ几
ＥＤＴＡ的等渗盐溶液，以Ｔｒｉｓ缓冲氯化氨溶红细胞液溶解红细胞，反复５次消化新生ｌ～３ｄ小白鼠额、顶骨得５群细胞，分别接种培养，经ＡＬＰ染色观察，第一群细胞ＡＬＰ染色细胞仅为６０％，第２～５群细胞ＡＬＰ染色呈强阳性，占９５％以上。说明第１群细胞中混杂的成纤维细胞、破骨细胞较多。作者根据Ｓａｎｄｉ的研究结果（骨组织中各种细胞耐受消化酶的能力依次为成骨细胞＞骨生成细胞＞破骨细胞＞成纤维细胞）认为，本实验中成纤维细胞、破骨细胞、骨生成细胞在消化中首先脱落存在于第ｌ群细胞中，而以后连续消化所得第２～５群细胞以成骨细胞为主，是本方法分离成骨细胞的理论根据。林清泉等１１９，２０Ｊ建立了胶原酶阶梯消化法进行鼠颅骨体外培养的生物模型。先用ｌ％的Ｉ型胶原酶在３７℃水温中振荡消化１５ｍｉｎ，再先后以０．５％、０．１％Ｉ型胶原酶同上法处理１．５ｈ。最后将成骨细胞纯化、鉴定。结果示所培养的细胞具有典型的成骨细胞特性，且成分单一。
黄洁等【２ｌＪ采用组织块法和胰酶相结合的方法进行成骨细胞的培养，骨粒经反复冲洗后，其表面黏附的骨髓细胞已大多去除，然后在培养液中培养
５
ｄ，其表面的骨髓细胞和少量成骨细胞贴壁，取出
骨粒后再给予胰蛋白酶消化，弃前２次（可能含有骨髓细胞）消化液，培养所得细胞即可获得纯度较高的成骨细胞，而骨粒反复胰酶消化可以获得较多的原代、一代细胞，避免长期培养、反复传代引起的细胞表型改变。
自１９７９年Ｍｉｌｌｓ首次体外成功地培养人成骨细胞后，不少学者对成人成骨细胞的培养进行了改良。张兴凯等［２２，２３Ｊ先用胰酶消化骨块以去除血细胞和成纤维细胞，骨片经短时培养后，再用胰酶消化，得到大量纯净成骨细胞。王海彬等【２４Ｊ以人松质骨为来源，采用反复冲洗、胶原酶预消化等预处理，再用胰酶消化，取得大量纯化的成骨细胞，比用单纯胶原酶消化后取得细胞纯化度高。
３
中药在成骨细胞体外培养中的应用研究随着现代分子生物学实验技术方法的不断改进
３１４
万
方数据和发展，一些学者尝试研究中药对成骨细胞的促增殖作用，目前主要集中在活血化瘀和补肾壮骨两类中药方面。
胡金家【２５Ｊ直接用杜仲叶作原材料，综合利用柱层析分级分离方法提取获得不同的部位，用新生ＳＤ大鼠颅骨作原代培养，取第一代细胞进行药效试验，观察与分析各分离部位对骨代谢的影响。结果显示
杜仲叶提取部位Ｉ、Ⅱ、Ⅲ对成骨细胞增殖与—６曲分泌
均有促进作用，以Ⅱ和Ⅲ部分的１０～５０浓度为佳。
具有补肝肾、强筋骨、活血化瘀的中药组方在治疗骨折上取得一定疗效，其作用机制尚不清楚，李秋静【２６ｊ对此做了有意义的探讨。选用接骨药（续断、骨碎补、土鳖虫、丹参、甜瓜子、煅自然铜）并用乙醇溶解其有效成分，调整其浓度为ｌ，５，１０，５０，１００肛ｇ／ｍｌ，用于人成骨细胞的体外培养，结果表明：接骨药能促进细胞的增殖，并且作用效果随时间的延长而增强。李勇Ｌ２’７Ｊ以增殖和矿化功能为指标，观察淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的影响，实验发现淫羊藿总黄酮对成骨细胞具有显著的促进增殖作用，且与淫羊藿总黄酮的含量有关，在１，１０弘ｇ／ｍｌ浓度时均促进成骨细胞增殖，但在１００肛ｇ／ｍｌ时可能因浓度过大而对成骨细胞增殖有抑制作用。
秦腊梅【２８］观察四味中药淫羊藿、女贞子、黄芪、大黄对成骨细胞株增殖情况的影响，结果发现：四味药物在适当浓度均能促进细胞增殖，其中黄芪在低浓度（５ｍｇ几）即显示促增殖作用，其作用强度与剂
量无明显联系；淫羊藿、女贞子高浓度组（５００懈／
Ｌ）较低浓度组（５ｍｇ／Ｌ）促增殖作用有上升趋势；大黄中浓度有促增殖作用，高浓度有抑制成骨细胞增殖作用。王拥军∞ｊ提取黄芪的主要活性成分黄芪多糖进行定性定量分析，认为黄芪多糖对成骨细胞的增殖、活性具有双向调节作用：在短期内促进成骨
细胞的增殖和增强ｍｊ活性，对自然衰老成骨细胞
的增殖能力也有一定恢复作用，而长期高浓度则抑制成骨细胞增殖，降低其活性。高晓燕［３０］观察到牛膝的醇提液及其石油醚和乙酸乙酯萃取的混合物对细胞具有较强的促增殖作用，因而认为牛膝中含有直接刺激成骨细胞增殖的成分。４应用前景
成骨细胞的体外分离培养已经取得了很大的进展，已从骨组织、骨膜及骨髓基质中分离培养出典型
的成骨细胞，并证实了其体内和体外的成骨能力。［１４］Ｌ成ｌ【ｌｉｎＲＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ
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生物节律可指导临床用药
自１９８５年英国科学家在果蝇身上发现第一个与生不同，如能在肿瘤细胞活跃的时候用药。疗效会大大提物钟相关的基因以来，人类已经发现了１２个与生物钟相高。近年的研究发现艾滋病病毒会使病人睡眠生物节律关的基因。第一个人类生物钟基因是我国旅美学者孙中发生改变，损害他们的中枢神经。国外研究还发现，生物生博士等人发现的。他们发现的这个基因在人白细胞中钟靠光调节，是从视网膜的～个独立通道直达下丘脑，不呈现２４ｈ谐振表达，研究成果于去年１２月发表在《血液》同于视觉通道，因此先天失明的人，不应该轻易摘除眼杂志上，引起了极大的轰动。
球，因为他们的眼球仍具有生物功能。
来自美国东卡罗来纳大学的学者丁健明说，近年生据透露，中国科学院即将建设行为遗传学研究平台，物节律在临床中的应用越来越引起科学家的重视，很多而生物钟研究将是其中一项重要内容。
医生认识到，正确的给药时间不但可以提高药效，而且可（摘自《健康报》２００４年６月２８臼３版）
以减低不良反应。例如肿瘤细胞与正常细胞分裂的时间
３１５
万
方数据