转基因步骤
农杆菌诱导的棉花下胚轴遗传转化
1:无菌苗的制备
a:现将准备好的棉花种子去掉外面的硬壳,在超净工作台上用0.1%的升汞灭菌8分钟(期间不断的摇晃小三角瓶)。将升汞倒回原来的瓶子后,用无菌水清洗3-4次,5min左右一次(清洗的期间不断地摇晃小瓶子)。
b:清洗完毕后,将种子转移到无菌培养基上,5—6颗每瓶(在转移时,所用到的勺子,镊子注意用酒精灯烧好,注意无菌操作)。 c:将已经转移好的培养基封口后,放入恒温培养箱培养。
d:恒温培养箱培养48h后扶苗(扶苗主要是将种皮去掉,将已经长出来的跟插入到培养基里面)。
e:96h后根据下胚轴生长情况切苗转化。
注意:上述全部过程都是在超净工作台上完成的,注意各个细节确保无菌操作。需要准备的器具有无菌水,两个灭菌的空瓶子,升汞,镊子,无菌培养基,酒精灯,种子。
2:切苗转基因
a:准备好需要的器具,两个带滤纸的大皿,带滤纸和不带滤纸的小皿数个,两把镊子,酒精灯。
b:切苗的要求,将生长正常无菌的下胚轴从无菌培养基上取出来
去掉两端多余的部分,用已经灭菌的刀片将其切成6-8 mm的小段,在切得时候要做到一刀两段,不能用刀片将下胚轴损伤。
C:在切了一半的时候可以准备要用的菌液(假设同时转两个基因,只用一瓶菌液)
1:取10ml MGL到三角瓶之中分别加入25ulAS
2:将已经准备好的菌液取适当的量到离心管中,离心一分钟后待菌体沉积到离心管底部时即可。
3:将需要转化的基因在三角瓶上编号,用MGL抽打菌液后,取少量菌液转入到不同基因的三角瓶内(在光下看到溶液为薄雾状即可)。 4:将带有编号的三角瓶放到摇床上>30min
5:将菌种转入到4摄氏度的冰箱中保存。
6:待切苗完成后,将下胚轴转入到对应的菌液中,8min后倒掉菌液,待下胚轴上的菌液完全干之后(可用小皿里的小滤纸反复吸收上面的菌液),将下胚轴转入到带有小滤纸的共培养。的培养皿中。 将转好的小培养皿放到恒温培养箱中,72h后转皿