酵母单杂交技术的原理及应用(1)
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酵母单杂交技术的原理及
应用
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中国人民解放军第 3 0 2 医院传染病研究所基因治疗研究中心 全军病毒性肝炎防治研究重点实验
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马守东洪源成军 酵母单杂交技术的原理及应用 世界华人消化杂志 加30
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弓l言
酵母单杂交(y e a s t o n e
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i d )技术是体外分析 D N A 与细胞内蛋自质相互作用的一种方法 ,
通过对酵母细胞 内报
告基因表达状况的分析 ,
来鉴别 D N A
结合位点并发现潜
在的结合蛋白基因 ,
或对 D N
A 结合位点进行分析运用此
技术 , 能筛选到与 D N A
结合的蛋 白质 ,
并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核昔酸序列 ,
而无需复杂的蛋 自质分离纯化操作 , 故在蛋白研究中 ,
具
有 一
定的优势; 而且 ,
酵母属真核细胞 ,
通过酵母系统 得 到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核
细胞内基因表达调控的真实情况
.
1
酵母单杂交技术的原理
酵母单杂交技术最早是 1
9 93 年 由iL te la
日夕
队酵母双杂
交 技术发展而来 ,
酵母双杂交技术通过对报告基因的 表 型进行检测 以实现对蛋 自质 间相互作用 的研究3[ 一
16
,
而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测 ,
分析 D N
A
、
蛋 自之间的相 互作用 ,
以研究真核细胞内
的 基因表达调控
目 前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参
与 这些转录因子通 常由一个D N A
特异性结合功能域和 一个或多个 与其他调控蛋自相互作用的激活功能域组
成 , 即 D N A 结合结构域(D N A 一
b i n d i n g d o m a i n
B D ) 和
转
录激活结构域(a e ri v a t l o n d o m a i n
,
A D ) 用于酵母单杂交
系统的酵母(
认 L4 蛋自即是一种典[12
表明 ( ; A
以的 D N A型 的转录因子 研究
结合结构域靠近梭基端,
含有几个锌指 结构 ,
可激活酵母半乳糖昔酶的上游激活位点U( A
S);而 转录激活结构域可与R N A
R N A
聚合酶或转录因子 T Fl lD
相互作用 ,
提高
D N A
聚合酶的活性 在这一过程中
,
结合结构域和转录激活结构域可 完全独立地发挥 作用 据此 ,
我们可将 G A 4L 的 D N A 结合结构域置换为
其他蛋自 ,
只要他能与我们想要了解的目的基因相互 作用 就照样可 以通过其转录激活结构域激活 R N A
,
聚合酶 ,
从而启动对下游报告基因的转录 正是基于这一
世界华人消化杂志 2 0 0 3 年 4 月 15 日 第 1 卷 第 4 期
2DN A
技术对 个不同的锌指蛋白的 结合结构域进行了分
]ot“4s ows
析 L i k y a, 在 19 9 9 年使用酵母单杂交技
“”
术 利用 一个 G C 富集 区序列筛选 出一种新的具有转
,
C;
片段与 G A IA 转录激活域融合表达的 D N A 文 库质粒 2( )含有 目的基因和下游报告基因的报告质粒 在实验中首先将报告质粒整合入酵母基因组 产生带有目的基因 ;;
的酵母报告株再将文库质粒转化人报告株若存在文库
理论 酵母单杂交系统由 2 部分组成 : ( 1)将文库蛋自
,
,
,
蛋白与目的基因的相互作用 可通过对报告基因的表达将文
,
库蛋白的基因筛选出来
.
2
酵母单杂交技术的应用
酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功能上
是由独立的
,
D N
A 结合结构域和 D N A 激活 结构域组成的
,
基础上 这使得研究者可以构建不同的基因融合体 在酵母中表达融合蛋白 以 同时结合特异的目的基因和激活转录 理
,
][z.
何 目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋自
:
目前 酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类
,
,
论上 在酵母单杂交技术中 任
,
,
21
A
鉴别 D N 结合位点 并发现潜在的结合蛋 白基 因
目前对 于酵母单杂交技术的应用 主要体现在这方 面 C h
ew te 盯
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应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存
一
、
在的 C O U P T F I E A R Z 和 N U R R I 等蛋白质是 G R IK S
基因 的内含子结合蛋白 从而进一步验证 了多种核孤儿受体可通过与内含子序列结合发挥其调控神经递质受体基
,
因作用的假设 W et aj 9 9 年运用此技术确定了特
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SpH
异性结合于海胆胚胎孵化酶( )E 基因调控区
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域 的反式激活因子 S P E 、 t 4 S i e e k e e r a l [9 1运用酵母单杂
交 技术对转录辅助因子进行了筛选 H u na g te 盯 l’ `J) 为分
一
离 与人 s 珠蛋 白基因上游沉默子片段相互作用的蛋
,
,
自 运用酵母单杂交技术 利用人肝 C D N A 文库进行筛
,
os
选 得到能与其结合的蛋白 RP ” i(r ho
M S
通过 电泳迁移率变动实验 (E )A 和竞争抑制实验证实其确有结合该沉默子活性 进而说明 R P L3 通过与人 。 -
。-珠蛋 自基因上游沉默子结合 在胚胎阶段的沉默人 珠
日{
蛋 白基因表达中扮演 了重要角色 iL a 。 el la ’ 于 02
S-
20 年运用酵母单杂交技术筛选出了能与大 鼠谷胧甘肤
,
aml orP eti
。
L3 ),并
,
转 移酶 G( s 乃 P 增强子 G E I 核心 序列相互作用的转录
P
D N A现 Y G EI 的插人片段与大鼠原癌基因 。 承In 、 具
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有 9 % 同源性 其编码的氨基酸残基序列与大鼠
p
·
因 子 经对 个阳性克隆 Y G P IE 和 G
,
2ppYP E Z
P
的鉴定发
,
’u, 蛋白具有 10 % 同源性 Y G P E Z 的插人 片段与大鼠线
,
刀
p
粒体腺昔酸转位酶 D N A 具有 9 % 同源性 其编码
,
C
的氨基酸序列与大鼠腺昔酸转位酶具有 0 同源性
,
1
%
,
并由此得出结论。 沪功蛋白和线粒体腺昔酸转位酶可能是
作用于 G P E I 的反式激活因子
.
2
N2A
对 D N 结合结构域进行分析 如果能得到 D A 结合结构域的结构信息 就可以用酵母单杂交技术对该结构进
,
行分析
]21
早在 1 9 39 年 就有人21( ” 用} 酵母单杂交
,
成军 慢性丙 型 肝炎病毒感染分子生物学发病机击 关基因的克隆化及其研究策略的进展
相
录激 活活性 的锌指 蛋白 ,
由于其结合 的序 列富含
“
G C ” , 故命名为 G C 一 b o x 结合蛋白 M a
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汉
1 [,”
运
户
用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋 一 环 一
螺旋
b( H L )H 结构的转录因子,
通过对肌调节因子 4 (M R F )4 的
研究 ,
证实其具有转录活性 ,
并进一步证明运用酵母单杂
交技术能在哺乳动物 C
D N A 文库中筛选 出与 E 一
b xo
D N A 相互作用的新的 b H L H 蛋 白 N i s ha。 。
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运
用酵母单杂交技术并结合点突变方法对转录活性片段 E 卜1 进行分析 ,
7一1
确定具有转录活性的区域位于第 8 57 碱基区
.
3 存在问题及解决办法 3 1
在鉴别 D N A 结合位点 中 存在的缺陷 由于细胞技术
的先天局限性, 即影响因子多DNA
, 因此 ,
可能有内源性的酵母
表达激活物与 结合位点结合,
并激活报告基因
的表达 ,
则相应的目的基 因片段可能 因此而被漏检
.
这个问题在试 图鉴定某基 因组中所有的 D N A
结合位点
时就会暴露出来此缺陷的补救需要一个更加随机 的文 库 例如 ,
可以用含有更多的已突变的片段构建一个随
机剪切的D N A 片段库 另一个 比较关合的问题就是此技术
的检测灵敏度 ,
有报道]2l
显示此系统对于 lH 3s 基因表达是非常灵敏的 ,
即使是很弱的、
甚或非特异性的相互作用都能被检测到 ,
这些非特异的相互作用可通过其他技术
21
避免 ,
但这也可能导致此方法灵敏度的过度下降 3 2
在 D N A
结合结 构域分析中存在的缺 陷 用酵母单杂交
技术分析突变导致 D N A
结合结构域改变的局限在于此
方法的灵敏度依靠
D N A 结合结构域功能选择, 只有当突变
影响了 D
N A 结合结构域的功能时,
才能被发现 改进的方
法是在培养基中选择合适的半乳糖浓度
2[]
,
以减少杂交
激活子的激活活性 ,
或用不同的阴性对照等方法
.
总之,
随着生物化学及分子生物学技术的不断发展
,
越来越多的大分子间相互作用被人们所认识 ,
这将有
助于人们阐明生物体 内各种生物学过程的发生情况 ,
并
可能由此发现新的基 因工程药物 酵母单杂交技术作
为一种研究生物大分子间的相互作用 的体外 、
细胞 内
技术 ,
从 1 9 9 3 年发展至今 ,
已有近 01 a 时间 ,
虽然
有关的报道不是很多 ,
但在生物学研究领域 ,
特别是在
一
研究 D N A 蛋白质相互作用方面他还是显示出了巨大 的应用潜力 ,
而且 ,
由酵母单杂交技术衍生出的反向单杂
交技术及单 一
双杂交技术更是拓宽了其应用范围]lv.运用
酵母单杂交技术不但可以验证许多已知的 D N A
-
蛋白质间相互作用 ,
而且可以发现新的D N A 一
蛋 白质间
相互作用 ,
并 由此发现新的基因 相信随着酵母单杂交
技术的不断发展和完善 ,
必将在科研 、
临床及生产中
得到更加广泛的应用
.
4
参考文献
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有效方法 中国医学科学院学报 2 0 0; 2 : 3 8 8 一19
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酵母双杂交系统的原理及应用
陈天艳成 军 张树林
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陈天艳 成军 中国人民解放 军第30 2 医 院传染病研究所基因治疗研究中
心 全 军病毒性肝 炎研究重 点实 验室 北京 市 1 0 0 39
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张树林 西安 交通大学第一 医院传染科 陕西省西 安市 7 0 0 16
项目负贵人: 成军 , 0 0 0 3 9 北京市中国人民解放军第3 02 医院传染病研究所
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陈天艳 成军 张树林 酵母双杂交系统的原理及应用 世界华人消化杂志 :
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