脑微透析技术及其在脑内药动学中的应用
脑微透析技术及其在脑内药动学中的应用
李范珠, 冯健(浙江中医学院药学系药剂教研室, 杭州310053)
摘要:目的 介绍脑微透析技术及其在脑药动学中的应用。方法 检索近年来国内外有关对脑微透析技术和脑药动学的研究性文献, 并进行分析、归纳。结果 综述了脑微透析技术的特点及其近几年的发展, 并介绍了脑微透析技术在脑药动学方面的应用。结论 脑微透析技术在脑药动学研究中具有不可替代的作用, 随着该技术发展, 应更有助于脑药动学发展。关键词:脑微透析; 药动学; 脑
中图分类号:R969 文献标识码:A 文章编号:1001-2494(2006) 06-0405-03 1972年,Delgado 等[1]首次发表了真正意义上的关于“微透析”的文章。从此, 微透析技术被广泛的成功的应用于各种实验, 并不断得以发展完善。当时, 作者进行的是脑微透析研究———将自制的顶部固定有透析包的导管埋植于10只恒河猴的尾状核和杏仁核中, 做了大量实验。
脑微透析技术是一种在体或离体脑化学采样技术, 其原理是脑细胞外液中可溶性分子可通过一种半透膜管的微小径孔顺浓度梯度扩散。半透膜管连接在经立体定位技术植入大脑特定部位的探针, 探针则与灌注泵相连, 与管外组织间液近似的人工脑脊液或其他液体, 。
1 脑微透析技术的特点和发展
diagram of concentric microdialysis probe
难, 这方面的报道也不多[324]。
2 脑微透析技术的影响因素
211 脑微透析的效率与以下几方面有关
探针的提取效率是指透析液中待测化合物的浓度与其在样品基质中浓度的关系。在实际应用中, 常用相对回收率推断其探针的提取效率。相对回收率的估计有多种方法, 常用的有外推至零流速法、零净流速法和反透析法等[5]。
21111 温度 Benveniste [6]研究发现:用37℃灌流液灌流, 微
脑微透析技术具有“在线、实时、活体、微量、高效”的特点, 因此, 可快捷有效地对脑内细胞外液中游离药物及其代谢产物进行实时监测, 取得药物在脑内的各项药动学参数, 尤其适用于具有脑靶向的药物。
脑微透析技术对脑组织损伤较小, 其低流速也使透析管中的流体静力压对大脑的影响作用降为最小, 且脑组织不与透析液直接接触, 大大减少了样品中杂质对微量物质测定的干扰。而且, 由于物质跨膜扩散的双向性, 脑微透析不仅可对脑部细胞外分子进行采样, 也可向脑内传递药物, 同时不会引起脑脊液或细胞外液的增加或丢失。
脑微透析探针有水平式和垂直式2种。垂直式探针有环状2U 型、并排状2I 型和同心圆型3种。探针的结构与大小对于透析的效率与活体组织反应很重要。植入U 型探针对于脑组织的损伤最大[2]。目前, 脑微透析选用最多的是同心圆型探针(带有导管和底座, 产品来自美国BAS 和瑞典
C M A ) 。典型的同心圆型微透析探针包含连接有进液和出液
透析相对回收率显著高于22℃灌流液。因为37℃灌流液有利于机体组织处于正常生理状态。
21112 灌流液灌流速度 相对回收率随着灌流速度的改变
呈反相变化, 但两者并非线性关系; 灌流速度从012增至210μL ・min -1时, 回收率大幅降低, 在2~10μL ・min -1时, 回收率保持相对恒定[7]。Orlowska 2majdak 等[8]认为, 家兔实验时, 微透析灌流速度在1μL ・min -1为宜。最多不超过215μL ・
min -1。
21113 透析膜材料的理化性质及其表面积 分子穿过透析
膜的能力取决于膜与分子的理化性质。对于不同相对分子质量的化合物来说, 能否被回收取决于透析膜的孔径[9]。相对回收率大小也直接与透析膜的孔径大小相一致。值得一提的是被透析化合物可能会与膜的材料相互作用, 尤其多肽和蛋白质类分子可能会非特异性地与膜“黏附”或与各种聚合物结合, 阻碍回收。为了提高透析膜的相对回收率, 在离体实验中选择适当的探针透析膜很重要, 但对于在体实验则
两根管子和一个圆柱状的透析膜, 见图1。
最近几年, 由于微透析材料及技术上的发展, 出现了同步多处脑微透析法。然而, 目前此法还存在诸多技术上的困
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371781)
作者简介:李范珠, 男, 教授, 博士生导师 T el :(0571) 86613756 E 2mail :lifanzhu@zjtcm 1net 中国药学杂志2006年3月第41卷第6期
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作用并不大。因为在体实验中, 机体组织对于透析过程中组织分子的扩散存在着反作用力, 并且是影响微透析相对回收率的关键因素[10]。因此, 同一物质在体回收率较离体回收率要低。Amberg 等[11]的实验结果也与建立的微透析分子扩散动力学的数学模型相一致。
212 灌流液成分
认为:组织反应轻微, 且局限在探针周围的部位。在脑微透析探针植入后肥大的星形细胞浸润透析膜。随着透析次数增多, 会出现胶质细胞增多、粒细胞浸润等。Shuaib 等[19]观察到:尽管在大鼠海马微探针植入部位周围存在轻微的神经细胞死亡、少量出血点和轴突变性, 但是在其远侧也同样发现了变性的轴突。在微透析探针植入24h 后, 血脑屏障的通透性也可提高, 这是因为探针周围的组织反应可使无法或极少能透过完整血脑屏障的血浆中的成分和药物可以透过血脑屏障进入脑组织, 影响回收率[20]。因此, 进行长期脑微透析时一般于植入24h 后就开始进行测定。急性实验时, 则在微透析探针植入后立即灌流, 获得稳定基线(一般在30min 后) , 开始收集样品。一般微透析探针植入后30min 血脑屏障仍能保持其完整性。G oldsmith 等[21]则发现脑微透析探针植入后2h 血脑屏障被重构。伊文思兰(Evan ′s blue ) 是一种血脑屏障示踪物, 在活体中与血清白蛋白结合。有研究发现探针植入脑后第1,3和7, 但在第。
orn 等[2:,
灌流液成分是脑透析实验中的重要因素。脑微透析灌流液与脑细胞外液直接接触并可能会影响局部的脑细胞外液的成分, 最终影响脑微透析实验的结果。
首先, 灌流液应与脑脊液等渗, 且酸碱度相近。其次, 应含有与脑脊液相一致的各种离子成分或者是脑细胞外的各种电解质成分。脑微透析灌流液中钠、钾、钙、镁离子的浓度对实验的影响较大, 如脑细胞外液中氯化钠浓度升高会导致中枢内许多氨基酸和神经递质的释放增加, 尤其在大鼠脑中可能引起多巴胺浓度的升高。H orn 等[12]认为, 这是因为脑细胞外液离子浓度的改变, 而并不是由于渗透压的改变。
Westerink [13]和Osborne [14]的实验均表明:灌流液中钾、钙、镁
离子浓度可显著影响局部多种神经递质的释放及其代谢物的浓度。R onne 2Engstrom 等[15]发现:灌流液中不含葡萄糖并不影响透析液中乳酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸的浓度, 可减少收集的透析液中的细菌生长。另外, 白蛋白(BAS ) 替代葡萄糖, 于透析膜上, 影响回收效率。子, , 防止其分解。
, 液, 一般含有NaCl , 2, K Cl , MgCl 2, NaHC O 3, NaH 2PO 4,
Na 2HPO 4等(浓度、成分报道不一) 。然而, 也有研究人员使用019%氯化钠溶液作为灌流液[8,16217], 并认为灌流人工脑脊液
、, , 导致透析回收率下降。, 作者权衡利弊后, 仍建议可长期留置微探针, 不认可在每天实验后将探针拔除, 次日再行埋植的长期实验。
3 脑微透析技术在脑内药动学(脑药动学) 中的应用
脑微透析技术是评价脑内药动学和药物输送到脑部(脑靶向) 的一项有效手段, 解决了以往主要以全脑匀浆法进行脑内药动学研究的问题。Devineni 等[22]将微透析技术成功应用于测定经动脉注射甲氨蝶呤后, 脑细胞外液对其的摄取。
也有研究人员将脑微透析技术应用于经鼻黏膜给药后药物在脑内的代谢过程。Bagger 等[23]给大鼠静注和单侧鼻黏膜给药盐酸利多卡因后, 研究了药物经嗅觉区吸收的模型。通过对盐酸丙胺卡因以反透析法测定在体回收率, 计算出真实的非结合利多卡因浓度。在纹状体和血液中在体相对回收率分别是1113%和24%, 平均数显著低于离体
(3113%和4411%) 。微透析探针埋置后1h , 发现血脑屏障仍
比灌流019%氯化钠溶液会更快地造成探针回收效能降低。原因可能是在长期微透析过程中探针内会形成水晶微粒, 堵塞透析膜孔。
213 微透析液的分析
微透析技术中, 由于透析后的稀释作用, 因此需要更灵敏的分析方法来检测其中的微量浓度的分子。
近20年来, 随着电生理学与神经化学的发展, 两者更多的、更成功的作为一种分析方法被结合运用在脑微透析技术之中。基于非分离的分析方法有放射免疫法(主要用于测定多肽类分子) 、在线生物感受器(on 2line biosens ors ) ; 基于分离的分析方法则可在线检测多种物质包括最常用的高效液相色谱法(HP LC ) 、高效毛细管电泳法(HPCE ) 。检测器有紫外吸收(UV ) 、荧光检测(F LD ) 、激光诱导荧光(LIF ) 和质谱(MS ) 等。
在线酶测定法与微透析法相结合, 近年来也屡见报道, 其中有流式酶2荧光测定法、流式酶2电流计测定法和序列式酶2电流计测定法。后两者主要用于伴有电生理记录的微透析实验。
214 脑微透析对脑组织的影响
保持着生理完整性。从时2效曲线的脑药动学模型中, 发现利多卡因经鼻黏膜和静脉给药后在双侧纹状体中的吸收率和曲线下面积(AUC ) 无统计学差异。利多卡因经鼻黏膜给药后, 在血、左右纹状体的平均生物利用度分别为85%,
103%,129%。作者认为没有证据证明经鼻黏膜给药后具有
显著的药物经嗅神经通路入脑的吸收作用。
Bagger 等[24]评价以荧光素钠作为亲水性而又极少能透
过血脑屏障的模型物质, 经嗅区吸收后, 以大脑为靶部位的可能性。微透析探针置于大鼠血液、两侧大脑(纹状体) 中。在静脉给药和单侧鼻黏膜给药后0~160min 时间段研究荧光素钠药动学。药动学模型显示, 与对侧相比, 与给药鼻孔同侧的纹状体具有更高的吸收率和更短的达峰时间。鼻黏
脑微透析探针的植入会引起脑组织反应, 但Lange 等
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[18]
膜给药后大脑清除率也比静注给药低。然而, 模型药物的大
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脑曲线下面积(AUC ) 与血浆曲线下面积(AUC ) 比值则很低
(2%~3%) , 并且无论何种给药途径, 两侧大脑半球之间也
没有显著差异。全脑匀浆法发现:大鼠右侧鼻黏膜给予荧光素钠后, 在右侧纹状体中测得的荧光素浓度比左侧纹状体高
40%左右, 这一结果与微透析法得出的结果相一致。研究证
实了药物经嗅区可转运至大鼠大脑, 但是, 荧光素钠以及绝大多数类似的其他亲水性化合物的药物靶向能力是有限的。
4 结 语
脑微透析技术是微透析技术的一种, 是一门新兴的、用途广泛的技术。近20年来发展迅速, 不断完善, 为中枢神经系统、生理和药理研究提供了有效的手段。脑内药动学是研究主要作用于脑部的药物在脑内的代谢动力学。随着国内外脑靶向药物研究的进一步深入, 脑内药动学也逐渐为人们所重视。脑微透析技术的发展也丰富和促进了脑内药动学的研究。但不可否认, 该技术仍存在手术对脑组织刺激、相对回收率低、相对回收效能保持和测定等的问题, 使这一技术应用仍有一定局限性。
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(收稿日期:2005202225)
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