8动物细胞的传代培养及冻存
动物细胞的传代培养及冻存、复苏
10121882 郭芳
动物细胞的传代培养
原理:传代培养(subculture)是体外培养的原代细 胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代,以 便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞,并 维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以 后,由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭, 将培养的细胞分散,从容器中取出,以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养,即为 传代培养。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段 期间,与细胞世代或倍增不同。
在一代中,细胞培增3~6 次。细胞传代后,一般 经过三个阶段:游离期、指数增生期和停止期。细 胞接种2~3天分裂增殖旺盛,是活力最好时期,称 指数增生期(对数生长期),适宜进行各种试验。
实验用品 器材:试管,吸管,橡皮头,培养瓶(都须彻底清 洗,烤干,包装好,灭菌后备用)倒置显微镜, 酒精灯,酒精棉球,试管架,CO2细胞培养箱包装 灭菌的灭菌工作服,口罩,帽子等。 试剂:PBS,细胞消化液:0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA钠盐液,DMEM液,3%谷氨酰胺,小 牛血清,7.4%NaHCO3,1万单位/ml青、链霉素溶 液,0.5%台盼兰染液。以上试剂均需分装,包扎 好,灭菌后备用。 材料:Hela细胞
实验步骤 (1) 配置营养液 DMEM液 90% 小牛血清 10% 双抗 100单位/ml 3%谷氨酰胺 1ml 7.4% NaHCO3 调pH至7.0-7.2 (2)用75 %的酒精擦拭双手,取出待传代的细胞。 移去培养皿中的旧培养基,加入5 mL PBS 清洗残 余的旧培养基,清洗两次,移去 PBS。
(3)向皿中加入适量0.25 %的胰酶和0.02 %的 EDTA 溶液进行消化,难消化的细胞可放入细胞培 养箱中若干分钟促进细胞消化。 消化过程:在上述瓶中加入适量消化液 (0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶液各一半)以盖满 细胞为宜,置于室温,停留2-3min后,肉眼观察细 胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙),如出现 空隙,即可倒去消化液,如未出现缝隙,则可将瓶 翻回,继续进行消化,直至出现缝隙。
倒去消化液,加入新配置的营养液3ml,以终止消 化。用 吸管吸取培养瓶中的营养液,反复吹打瓶 壁上的细胞层,直至瓶壁细胞完全脱落。继续轻轻 吹打培养杨,以使细胞散开。随即补充营养液并以 1:2 或更高比例分装。 (4)将分装好的细胞瓶做好标记,注明细胞代号、 日期、置于培养架上,轻轻 摇动,以使细胞均匀 分布,以免细胞堆积成团,然后置于含5 % CO2, 37℃细胞培养箱培养。
(5)观察 细胞培养24h后,即可进行观察,主要观察: 细胞是否被污染,主要观察培养液颜色的变化及浑 浊度。 培养液正常
情况下为桃红色;颜色变黄时,必须换 液。真菌污染较为多见,大多形成白色或浅黄色小 点浮于培养表面,肉眼可见;有的散在生长,镜下 观察呈丝状,管状,树枝状菌丝,此时,培养液透 明。 观察细胞是否生长 如细胞已生长,则要观察细胞的形态特征并判断其 所处的生长阶段。
对数生长期的细胞特点:细胞透明,颗粒少,细胞 界限分明,细胞核隐约可见。细胞占瓶壁有效面积 25%-75%以内,有新生细胞;75%-95%时细胞排列 紧密,有空隙;95%以上,细胞致密,透光性好。 观察完毕后,用台盼兰染色,以确定死,活细胞的 比例。
传代培养试剂的作用
消化液的作用:当细胞生长成致密单层时,容易被 蛋白水解酶和EDTA破坏,因为EDTA对钙,镁离 子具有亲和力,而这两种离子是细胞保持紧密结合 所必需的因素。
小牛血清的作用:小牛血清提供细胞生长繁殖所必 须的生长因子,氨基酸等多种天然营养因素。
台盼兰:细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的 细胞膜,与解体的DNA 结合,使其着色。而活细 胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活 细胞。
实验注意 1. 在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。 为此,在操作前要认真地洗手并用75%乙醇消毒。 操作前20~30 分钟起动超净台吹风。
2. 操作时,严禁说话,严禁用手直接拿无菌的物品, 如瓶塞等,而要用器械,如止血钳、镊子等去拿。 3. 培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞,打开之前用 乙醇将瓶口消毒,打开后和加塞前瓶口都要在酒精
灯上烧一下,打开瓶口后的操作全部都要在超 净台内完成。操作完毕后,加上瓶塞,才能拿 到超净台外。
4. 使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿 末端,将尖端在火上烧一下,戴上胶皮头,然 后再去吸取液体。在整个无菌操作过程中都应 该在酒精灯的周围进行。
5.消化时间要适度,过短 细胞不易脱落,过长细胞 脱落流失。 6.消化液浓度要适宜,过 浓时消化作用强烈,细胞 反应快,所需消化时间短, 掌握不好,细胞易流失。 不同细胞对消化反应不同。
冻存及复苏
原理: 在 低于 -70度的超低温条件下,有机体细胞内部的 生化反应极其缓慢,甚至终止。因此,采取适当的 方法将生物材料降至超低温,即可使生命活动固定 在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存 的生物材料恢复至常温时,其内部的生化反应可恢 复正常。
冻存:将体外培养物或生物活性材料悬浮在加 有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻 速率降至零下某一温度(一般是低于 -70度的 超
低温条件),并在此温度下对其长期保存的 过程。 复苏:是以一定的复温速率将冻存的体外培养 物或生物活性材料恢复到常温的过程。
原理补充 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快 融,实验证明这样可以最大限度的保 存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘 油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物 质能提高细胞膜对水的通透性,加上 缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞 外,减少细胞内冰晶的形成,从而减 少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复 苏细胞应采用快速融化的方法,这样 可以保证细胞外结晶在很短的时间内 即融化,避免由于缓慢融化使水分渗 入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成 损伤。
实验用品 器材:净化工作台,离心机,恒温水浴箱冰箱 (4℃、-20℃、-70℃),倒置相差显微镜,培养箱, 液氮,冰箱,吸管(弯头、直头),培养瓶玻璃瓶 (250ml、100ml),废液缸,移液管(10ml), 15ml离心管,冻存管(1~2ml),微量加样枪,红 血球计数板,医用橡皮膏,移液枪
试剂:D-Hanks液,小牛血清, 培养液双抗(青霉 素、链霉素)胰蛋白酶(0.08%),1NHCl , 7.4%NaHCO ,DMSO或无色新鲜甘油
冻存实验步骤 1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻 存培液
2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长 的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移 至15ml离心中;
3. 离心1000rpm,5min;
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配 制好的冻存培养液,用吸管 轻轻吹打使细胞 均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度 5×106/ml~1×107/ml;
5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;
冻存过程
1.先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。
2.接着置于-20℃冰箱,约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。 5同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录
复苏过程
1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中, 并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管,在超净台处打开盖子, 用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上 培养液,混匀; 3. 离心, 1000rpm,5min;
4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重 悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶, 37℃培养箱静置培养; 5. 次日更换一次培养液,继续培养。
冻存注意 1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞 都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻 存前一天最好换一次培养液; 2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好 防护工作,
以免冻伤; 3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。
4.使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有 灭菌的作用。高压灭菌会破坏其分子结构,以至于 降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有害, 故在配制时最好戴上手套操作。 5.不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围 内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是 “危险温区”。 6.注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。
复苏注意 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。 细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温 急剧上升,可导致爆炸。
2. 冻存液的问题:二甲基亚砜(DMSO)对细胞不 是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞 的毒副作较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完 全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤, 二甲基亚砜(DMSO)最好选择进口产品。
3. 离心前须加入较多培养液。细胞解冻后二 甲基亚砜浓度较高,加入培养液可稀释其浓度, 以减少对细胞的损伤。
谢谢!