肥大细胞Toll样受体2标记物对土拉弗朗西斯菌的有效杀伤的重要性

姓名：戴富强 专业：临床医学外科学 学号：20131429

肥大细胞TLR2信号在有效杀伤土拉弗朗西斯菌中的重要性

摘要：Toll样受体信号在对早期病原体感染中具有重要作用，但肥大细胞Toll样受体在肺部感染的作用机制和后续效应功能还很不清楚。先前试验表明肥大细胞通过释放白介素—4，有效的控制土拉弗朗西斯菌的复制。在本实验中，人类高毒性的土拉弗朗西斯菌的SCHU S4和高活性的牛痘疫苗用来研究肥大细胞Toll样受体在抑制土拉弗朗西斯菌中的作用。细菌的有效杀伤有赖于肥大细胞的TLR2、水解酶L的监管、MHC-II分子的协调及溶酶体相关蛋白2。被感染的TLR2阳性的肥大细胞与野生型TLR4阳性的肥大细胞相比，缺乏可检测到的白介素-4b,表现为促进细胞凋亡和增加土拉弗朗西斯菌2-3的对数复制，但可以被rIL-4治疗。重要的是，MHC-II分子和溶酶体相关蛋白2定位标记的肺内土拉弗朗西斯菌野生型比TLR2阳性的多。结果表明肥大细胞和TLR2相关信号在肺组织感染的早期固有免疫和通过提供增强细胞内病原体免疫防御机制中的重要影响。

肥大细胞类似于‘哨兵’，识别细菌通过产生表面受体模式例如TLR2和TLR4。尽管肥大细胞产生细胞因子受到TLR的调控已经有文献表明了，但仍有很多有关在细菌感染中肥大细胞TLR信号传导和功能不清楚。在树突状细胞中，TLR信号可触发吞噬细菌作用和促进吞噬体成熟的作用，这可引起初期吞噬体与核内体以及吞噬溶酶体融合。吞噬作用、吞噬体的成熟以及吞噬体沿着微管移向核周区域都要求最佳的PH环境。尽管在树突状细胞中这种成熟过程已经被阐明，但在肥大细胞吞噬作用中TLR功能的作用还没有被阐明。

髓系细胞中吞噬体的成熟是被CD63、溶酶体结合膜蛋白1\2以及Rab7等蛋白质所标记，在这个过程中其他的蛋白质包括V-type ATPase、MHCⅡ类分子和溶酶体水解酶参与。溶酶体酶包括多种细胞自溶解素，包括丝氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸蛋白酶。在众多细胞自溶解素中，细胞自溶解素L是细胞内环境稳定、自我吞噬、凋亡、抗原提取与提呈等的关键。更重要的是这种蛋白酶还在多种疾病中涉及到，其中包括：糖尿病、癌症、肺部炎症等，因此可能参与调节和维持内环境稳定。

在理想的环境下，吞噬体/溶酶体的融合导致PH减低和蛋白酶活化，达到杀死吞噬溶酶体内病原体的目的。然而，大量病原体通过修饰与吞噬体结合或影响吞噬体成熟过程而产生逃避机制。例如：分支杆菌spp.区Rab-5、利什曼原虫spp抑制吞噬体成熟以及伯纳特氏柯克斯氏体将吞噬体变换为子吞噬体。肺部兔热病的病原体土拉弗朗西斯菌逃避吞噬体来避免溶酶体降解并在巨噬细胞内大量复制。

TLR2信号和随后的免疫反应对控制土拉弗朗西斯菌引起的肺炎免疫中起很重要作用。而TLR2已被证明参与土拉弗朗西斯菌属的脂蛋白的识别，野生型(WT),TLR2阴性和TLR4阴性巨噬细胞也表现出对土拉弗朗西斯菌感染类似的易感性。我们最近研究表明,肥大细胞在机体肺部感染土拉弗朗西斯菌的生存过程中的特殊作用，并且肥大细胞与巨噬细胞共培养可促进杀伤病菌，这个过程中机体经分泌IL-4和增加巨噬细胞胞内的ATP产物以及随后的酸化来完成的。

尽管细胞内酸性条件可以控制微管的转运，Yates和Russell已经证明巨噬细胞信号TLR2/4不被吞噬体成熟所需要，这里对肥大细胞TLR的功能和它对细胞转运以及溶酶体功能的控制有一定的提示。因此，通过应用土拉弗朗西斯菌人类高亲和毒性毒株SCHU S4和土拉弗朗西斯菌活的疫苗株，我们研究发现了肥大细胞产物TLR2/4和IL4杀伤病菌的功能。

我们的发现证明了肥大细胞TLR2是细胞内蛋白最佳的转运关键，以及是机体有效应答土拉弗朗西斯菌感染的关键。

材料、实验方法

小鼠

全过程应用4至8周龄的无特殊病原菌小鼠。小鼠C57BL/6是从国家癌症研究所购买的。TLR2阴性和TLR4阴性小鼠都是由M.T.Berton博士提供。所有的实验过程和动物养护都严格执行动物保护和使用委员会指导指南

细菌

土拉弗朗西斯菌活的疫苗株（要求从新墨西哥大学R.Lyons博士获得）、土拉弗朗西斯菌SCHU S4（要求从疾病控制中心获得）以及mCherry活的疫苗株（KKF314）是在补充L-半胱氨酸的大豆胰蛋白酶的液体培养基中培育的。实验所应用的SCHU S4是在动物生物技术安全三级设施中管理培育的。

在体外感染的初代细胞

肥大细胞是来源于小鼠骨髓和前面所详细描述的体外感染。简单地说, 在没有细胞因子感染的休眠期细胞被计数、固定和孵化4小时。然后细胞被感染2 h，再用庆大霉素治疗1 h，在37 摄氏度下洗涤、孵化，并在不同阶段进行分析。在3、12或24小时原位激发活的疫苗株((MOI)感染复数价100)或土拉弗朗西斯菌SCHU S4(MOI100)，细菌是使用细胞溶菌产物稀释平板计数。在分离实验中,小鼠rIL-4(5或25 ng / ml;单抗)被添加到被感染之前的细胞中培养2 h并且每次洗涤后rIL-4被取代。细胞被用于测定细菌的复制和蛋白质的表达式。 体内攻击和流式细胞术

用1或10的LD50活的疫苗株或用PBS对6到8周龄的C57BL/6和TLR2阴性的小鼠进行滴鼻模拟攻击。在2到4天的定位攻击后安乐处死小鼠。对肺灌注1倍的PBS并通过一个70纳米细胞滤网滤过，或注射福尔马林到气管并使肺部充满中性的福尔马林一个晚上，使肺组织脱水固定并嵌入在石蜡中。连续切成5纳米厚的切片备用。组织切片用1倍的烫/洗缓冲剂透化，并用BSA或鼠血清填充。组织用共轭碳氟化合物抗体在室温下染色45分钟，抗体包括抗体CD117、抗体LAMP2、抗体CD49b、抗体CD11c、抗体F480（生物科学）以及DAPI。肺细胞用2%的FBS在1倍的0.09%的叠氮化钠的PBS中洗涤，然后在4摄氏度下用10%的鼠血清在1倍的PBS中填充30分钟。洗涤样品，并用适量的共轭碳氟化合物抗体表面着色，或同种型对照，在4摄氏度下孵化30分钟后洗涤。样品用细胞色素氧化酶fix/细胞色素氧化酶perm固定20分钟，用PBS洗涤，然后用1倍的烫/洗处理10分钟，并将洗液去除。这时细胞用共轭碳氟化合物抗体着色，或同种型对照稀释在100微升1倍的烫/洗也中并加入适量的样品细胞中。样品在间歇震荡中孵化60分钟，再用1倍的烫/洗液洗涤，并悬浮在2%的多聚甲醛溶液中用流式细胞仪进行分析（FACSCalibur；BD 生物科学）。数据分析用CellQuest Pro软件来完成（BD 生物科学）。肺组织还需用510变焦显微镜进行检测，并且数据用Imaris软件来进行分析（Bitplane, St. Paul, MN）。

为了在试管内分析肥大细胞和共培养物，分别在15分钟、30分钟、60分钟、3小时、12小时和24小时分别收集肥大细胞并用PBS洗涤。随后样品在4摄氏度下用抗鼠

CD16/CD32(BD 生物科学)或用10%鼠血清封闭，之前要添加共轭碳氟化合物表面抗体和/或像上面所描述的细胞内着色。碳氟化合物抗体包括FcεRI (PE), c-Kit FITC (克隆 2B8; BD 生物科学), CD11b(FITC or 别藻蓝素), CD206 (克隆 MR5D3; BioLegend)，还有同型对照（IgG1-PE, IgG2aκ-FITC, IgG2aκ-别藻蓝素, IgG2aκ -Alexa 488）。为了细胞自溶酵素L的间接染色，第二抗体与共轭碳氟化合物 Alexa 488 或磺酰罗丹明101一起使用。门控分析包含侧散射花生凝集素对的原始肥大细胞，或者CD11b的巨噬细胞。数据使用

Cell-Quest Pro软件分析。

显微镜检查

荧光黄标记的细菌用来在试管内感染，正如之前所描述的；为能够实时观察肥大细胞，应将肥大细胞培养在聚苯乙烯的试管中或培养在加入包含0.1%明胶的10%的RPMI1640的一个45mm的培养盘中。为酸化分析，在感染之前，在培养基中加入一种特殊的酸化探针（LysoTracker Red DND-99;Invitrogen, Eugene, OR）并在37摄氏度下孵育30分钟。像前面所介绍的表面染色的特定时间段收集和染色肥大细胞，并用添加荧光黄标记的活的疫苗株，随后在室温下固定、透化及胞内染色2小时。一CytoPro用离心机800转/分钟离心4分钟，并将细胞收集到镀多聚-l-赖氨酸的玻片上。将permount加到玻片上，盖上盖玻片，并在黑暗中室温下干燥一整夜。样品用共聚焦显微镜（Zeiss 510 Meta; Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY）观察，并用Imaris软件来进行数据分析。用私人的

DeltaVision荧光反褶积显微镜在60倍或100倍物镜下实时观察野生型细胞和TLR阴性肥大细胞。在获取细胞图像时，细胞应保持在37摄氏度下并且空气中二氧化碳含量在5%，并每60秒拍摄一张图片。

用蔡司透镜激光切片机510倍共聚焦显微镜对肺组织进行分析。检测荧光团的设置和激光包括：405 DAPI的检测 (BP 420–480), 488 Alexa 488的检测 (NFT 490 and BP 505–530), 594 mCherry 的检测(NFT 545 and BP 560–615), and 633 allophycocyanin的检测(NFT 545 and LP 650)。

统计

用SigmaStat统计软件对数据进行t检验分析。P的检验标准采用统计学广泛应用的0.05。结果至少是两个独立实验的代表性结果。

结果

野生型和TLR4阴形的肥大细胞可有效抑制土拉弗朗西斯菌的复制，而TLR2阴性的肥大细胞则不能抑制土拉弗朗西斯菌的复制。

缺陷TLR2的小鼠在感染肺部土拉弗朗西斯菌后表现出比野生型小鼠要高很多的死亡率。我们将感染土拉弗朗西斯菌的野生型和TLR缺乏型的肥大细胞抑制病菌复制情况进行对比，发现野生型TLR2阴性并且TLR4阴性的巨噬细胞对土拉弗朗西斯菌表现出相似的敏感性，并且研究结果明显显示肥大细胞对抑制细菌复制和肺感染土拉弗朗西斯菌的小鼠存活都很重要。在被活的疫苗株和人类高侵袭A型菌株，SCHU S4，感染的野生型肥大细胞与感染的TLR2阴性并TLR阴性的肥大细胞对比的过程中3h和24h时，细菌复制被检测到。这些数据显示活的疫苗株和SCHU S4在野生型和TLR4阴性的肥大细胞中细菌复制均被抑制，而TLR2阴性的肥大细胞则表现明显（p，0.002）的细菌增殖（2-3 log）在与野生型肥大细胞对比24h时。巨噬细胞被用来作对照，并明显显示在初始野生型巨噬细胞中，活的疫苗株和SCHU S4都持续稳固的复制。这些结果说明TLR2可识别病原体并且TLR2信号是控制土拉弗朗西斯菌在肥大细胞内复制的关键。

TLR2阴性的肥大细胞缺乏可检测到的IL-4产物并在感染后立即显示出激活的组织蛋白酶L的减少。

我们已经证明了IL-4是肥大细胞抑制土拉弗朗西斯菌复制的关键，并且TNF-a已经被证实在机体抵御病菌的天然免疫系统中是非常重要的，从野生型，TLR2阴性和TLR4阴性的肥大细胞模拟液中及感染活的疫苗株的肥大细胞液中收集上清液来检测产物IL-4和

TNF-a。在活的疫苗株感染的野生型的肥大细胞和TLR4阴性的肥大细胞中都可检测到IL-4和TNF-a，然而，TLR2阴性的肥大细胞则检测不到产物IL-4，但产生与野生型肥大细胞相似水平的TNF-a。与野生型肥大细胞和TLR2阴性的肥大细胞对比，活的疫苗株感染的TLR4

阴性的肥大细胞的产物TNF-a显著减少。与野生型肥大细胞和TLR4阴性的肥大细胞对照，活的免疫株感染的TLR2阴性肥大细胞显示对微生物显著敏感，但IL-4产物减少，这额外的证明了TLR2的关键作用。

因为IL-4治疗可增加酸化吞噬体在土拉弗朗西斯菌感染的过程中，并且水解蛋白组织蛋白酶L已经被证实可被IL-4所促进，随后用流式细胞术对组织蛋白酶L进行了分析。这些分析结果显示与野生型肥大细胞比较，在早期被感染的TLR2阴性的肥大细胞有活性的组织蛋白酶L的表达减少。再被活的疫苗株攻击一小时后，野生性的肥大细胞中组织蛋白酶L表达增加，而TLR2阴性的肥大细胞则减少。综上所述，这些结果说明对于在肥大细胞中IL-4表达产物和随后的组织蛋白酶L合成的控制，TLR2对土拉弗朗西斯菌的识别和下游信号很重要。

TLR2阴性的肥大细胞在感染土拉弗朗西斯菌的过程中表现出LAMP和MHCⅡ转运和酸化的改变。

因为IL-4已经被证实在巨噬细胞中有上调MHCⅡ的表达和酸化，另外，LAMP2的蓄积在吞噬体的成熟和随后的吞噬体与溶酶体融合的过程中发挥重要作用，MHCⅡ和LAMP2可在被荧光黄标记的活的疫苗株感染的野生型、TLR2阴性及TLR4阴性的肥大细胞中检测到。用流式细胞术分析早期的活的疫苗株感染的肥大细胞表面MHCⅡ的表达显示，与TLR2阴性肥大细胞相比野生型肥大细胞MHCⅡ表面蛋白表达减少，这表达了几乎低于后者两倍水平，并且与TLR4阴性肥大细胞相似。这时用共聚焦显微镜观察MHCⅡ与标记的活的疫苗株共定位的关系。有趣的是，共聚焦显微镜分析显示，尽管TLR2阴性肥大细胞表面显示高水平的MHCⅡ分子表达，但胞内标记的MHCⅡ分子减少，并且有大量的活的疫苗株在胞内存活；与这相比，野生型肥大细胞表现胞内大量的MHCⅡ与荧光黄标记的细菌高度结合。为进一步研究，我们用三维立体共聚焦显微镜在高倍放大和更直观下分析显示，在早期活的疫苗株感染的野生型肥大细胞中MHCⅡ分子与LAMP2位置蛋白高度聚合，与这比较，TLR2阴性的肥大细胞中MHCⅡ和LAMP2位置蛋白散布在整个细胞中而不聚合。然而，当与野生型肥大细胞相比较，在3小时的TLR2阴性的肥大细胞中随着c-Kit阳性荧光蛋白的减少，转运到细胞表面的MHCⅡ和LAMP2分子增加。而且，与野生型肥大细胞相比较，在TLR2阴性肥大细胞中荧光黄标记的细菌水平显著增加，这与细菌平皿计数相一致。因为TLR2阴性肥大细胞展现出活的疫苗株复制增强，并且MHCⅡ与酸化标记的共区域化减少。我们通过检测产物半胱氨酸-3的活性分析细胞的死亡以及rIL-4在这个过程中的作用。重要的是，当与有相似感染情况的野生型和TLR4阴性肥大细胞相比较时，感染活的疫苗株和SCHU S4的TLR2阴性肥大细胞展现出活性的半胱氨酸-3的表达减少。然而，向TLR2阴性的肥大细胞中添加rIL-4可以降低半胱氨酸-3的感应活性，并获得与野生型肥大细胞相似的抑制SCHU S4细菌复制的能力。这些结果证明，肥大细胞的TLR2可识别土拉弗朗西斯菌并且间接通过下游信号促进吞噬体成熟、转运LAMP2和MHCⅡ分子，并杀伤土拉弗朗西斯菌，这很可能与IL-4信号有关。添加rIL-4到感染SCHU S4的TLR2阴性的肥大细胞中，可使其避免凋亡，并且有效促进其对病菌的杀伤。

在感染的肺中用mCherry标记的活的疫苗株渗透和定位肥大细胞

在土拉弗朗西斯菌感染过程中，在试管内的野生型和TLR2缺陷的肥大细胞之间有显著的不同，从中我们分析到，在肺感染后的早期细胞性活动以及肥大细胞移行到肺中的现象。C7BL/6小鼠用mCherry标记的活的疫苗株鼻内感染，并且在感染2和4天时分别从肺中收集细胞。在感染2天的肺组织中，几乎没有检测到c-Kit阳性细胞，这与前面的研究结果相一致。然而，在感染4天后，肺部被证实存在细胞浸润。同时，从活的疫苗株感染的野生型小鼠收集到肺组织分析显示显著的LAMP2分子聚合，它环绕在mCherry标记的活的疫苗株周围，而与此相比较，从感染4天后的TLR2阴性的小鼠肺组织中则没有此现象。然而，

与TLR2阴性的肺切片相比，野生型中那些区域中LAMP的着色强度非常显著。

因为树突状细胞亚群和NK细胞已被证实表达c-Kit，所以肺细胞用来分析c-Kit的表达，而CD49b和CD11c除外。收集用mCherry标记的活的疫苗株感染的野生型小鼠肺部细胞，并用流式细胞术对进行分析，显示在肺感染土拉弗朗西斯菌期间，主要表达c-Kit的细胞的是肥大细胞和NK细胞。在感染4天后，26%的肺部细胞c-Kit阳性；65%cKit阳性的细胞同时FcεRI阳性，这表明是肥大细胞，并有8.5%CD49b阳性，说明是细胞毒性的NK细胞。重要的是，肺细胞分析也表明，在肺感染期间，尽管mCherry c-Kit阳性细胞很难检测到，但c-Kit阳性细胞仍与土拉弗朗西斯菌相互作用。因为野生型肥大细胞可以抑制土拉弗朗西斯菌复制，所以实时细胞图像用来进一步分析野生型肥大细胞及TLR2阴性肥大细胞与土拉弗朗西斯菌的相互作用。实时细胞图像显示，与TLR2阴性肥大细胞相比，野生型肥大细胞是偏振光束、高度活化的，并且能对荧光黄标记的活的疫苗株有效杀伤。还有，TLR2阴性肥大细胞的实时细胞图像显示其能有效吞噬荧光黄标记的活的疫苗株；但细菌没有被局限在酸化区域，反而持续在肥大细胞中存活。野生型肥大细胞的连续图像在吞噬细菌过程中显示偏振光束的酸化区域，与此相比，TLR2阴性肥大细胞的酸化区域仅围绕在其周围。同样的，野生型肥大细胞的实时细胞图像显示快速的吞噬细菌，酸化，并且活的疫苗株减少，暗示吞噬体和吞噬溶酶体快速成熟的过程。重要的，这些结果与细菌平板计数相一致，表明TLR2阴性肥大细胞能有效地吞噬病菌，但病菌可在其胞内存活并繁殖，而野生型肥大细胞则可有效杀伤这些病原体。

讨论

肥大细胞对粘膜病原体可进行动态防御。为控制某一病原菌的肺部感染，如土拉弗朗西斯菌、结核杆菌和绿脓杆菌，都需要TLR2受体信号。这个研究对肥大细胞识别病菌和控制感染有了更进一步的深刻认识。重要的是，肥大细胞TLR2介导的天然免疫应答包括：最优的转运和早期LAMP2、MHCⅡ以及组织蛋白酶L的积累，这是从有效杀伤土拉弗朗西斯菌的结果中得出的。树突状细胞以TLR信号和后期溶酶体的活动为主要特征。Trombetta及其他研究者，用脂多糖来研究成熟的树突状细胞的空泡泵的积聚，得到可增强酸化溶酶体和抗原蛋白水解酶功能的结果。这些树突状细胞同时表现出MHCⅡ类分子的聚积。Blander 和 Medzhitov两人后来证实树突状细胞对脂多糖的TLR4受体是吞噬体成熟和识别自身细胞与异物抗原蛋白的关键。与此相对，Yates和Russell用Pam3Cys-Ser-(Lys)4或脂多糖刺激骨髓中的巨噬细胞，可证明吞噬体的成熟独立于TLR2和TLR4的刺激。尽管在上面体外系统实验中的记录结果有很大的不同，但在我们的试验中IL-4是肥大细胞活化的主要成分。我们先前的研究证实骨髓衍生的巨噬细胞对土拉弗朗西斯菌感染高度耐受；然而，当其与肥大细胞共培养或添加rIL-4可显著的减少病菌的复制。重要的是，我们发现骨髓中的巨噬细胞在感染过程中不能产生IL-4，与此不同的是，骨髓中的肥大细胞则可产生。我们还有证据显示在肥大细胞和巨噬细胞共培养物中，肥大细胞产生的IL-4产物可以促进巨噬细胞增加ATP产物和随后的吞噬体酸化。因此，Yates和Russell实验结果与此不同，可能是片面的归因于巨噬细胞缺乏IL-4产物。

以前的研究表明IFN-r和TNF-a是在土拉弗朗西斯菌感染过程中主要的控制机制。然而，在肥大细胞中添加IFN-r可提升对活的疫苗株的杀伤，并增加IL-4 的产生；TNF-a不能充分诱导肥大细胞对土拉弗朗西斯菌的杀伤，如同TLR2阴性肥大细胞多表现的一样，这种结果与野生型肥大细胞有相似的水平。尽管TNF-a诱导的活性氧被证实可以促进信号介导的IL-4受体途径，但IL-4信号的启动不需要TNF-a。IL-4可增加ATP产物、促进组织蛋白酶L活化并使吞噬体酸化。此外，我们发现，TLR2信号是肥大细胞感应IL-4分泌物、最佳的组织蛋白酶L的活化以及吞噬体的成熟所必需的，这就导致LAMP2和MHCII分子定位于土拉

与TLR2阴性的肺切片相比，野生型中那些区域中LAMP的着色强度非常显著。

因为树突状细胞亚群和NK细胞已被证实表达c-Kit，所以肺细胞用来分析c-Kit的表达，而CD49b和CD11c除外。收集用mCherry标记的活的疫苗株感染的野生型小鼠肺部细胞，并用流式细胞术对进行分析，显示在肺感染土拉弗朗西斯菌期间，主要表达c-Kit的细胞的是肥大细胞和NK细胞。在感染4天后，26%的肺部细胞c-Kit阳性；65%cKit阳性的细胞同时FcεRI阳性，这表明是肥大细胞，并有8.5%CD49b阳性，说明是细胞毒性的NK细胞。重要的是，肺细胞分析也表明，在肺感染期间，尽管mCherry c-Kit阳性细胞很难检测到，但c-Kit阳性细胞仍与土拉弗朗西斯菌相互作用。因为野生型肥大细胞可以抑制土拉弗朗西斯菌复制，所以实时细胞图像用来进一步分析野生型肥大细胞及TLR2阴性肥大细胞与土拉弗朗西斯菌的相互作用。实时细胞图像显示，与TLR2阴性肥大细胞相比，野生型肥大细胞是偏振光束、高度活化的，并且能对荧光黄标记的活的疫苗株有效杀伤。还有，TLR2阴性肥大细胞的实时细胞图像显示其能有效吞噬荧光黄标记的活的疫苗株；但细菌没有被局限在酸化区域，反而持续在肥大细胞中存活。野生型肥大细胞的连续图像在吞噬细菌过程中显示偏振光束的酸化区域，与此相比，TLR2阴性肥大细胞的酸化区域仅围绕在其周围。同样的，野生型肥大细胞的实时细胞图像显示快速的吞噬细菌，酸化，并且活的疫苗株减少，暗示吞噬体和吞噬溶酶体快速成熟的过程。重要的，这些结果与细菌平板计数相一致，表明TLR2阴性肥大细胞能有效地吞噬病菌，但病菌可在其胞内存活并繁殖，而野生型肥大细胞则可有效杀伤这些病原体。

讨论

肥大细胞对粘膜病原体可进行动态防御。为控制某一病原菌的肺部感染，如土拉弗朗西斯菌、结核杆菌和绿脓杆菌，都需要TLR2受体信号。这个研究对肥大细胞识别病菌和控制感染有了更进一步的深刻认识。重要的是，肥大细胞TLR2介导的天然免疫应答包括：最优的转运和早期LAMP2、MHCⅡ以及组织蛋白酶L的积累，这是从有效杀伤土拉弗朗西斯菌的结果中得出的。树突状细胞以TLR信号和后期溶酶体的活动为主要特征。Trombetta及其他研究者，用脂多糖来研究成熟的树突状细胞的空泡泵的积聚，得到可增强酸化溶酶体和抗原蛋白水解酶功能的结果。这些树突状细胞同时表现出MHCⅡ类分子的聚积。Blander 和 Medzhitov两人后来证实树突状细胞对脂多糖的TLR4受体是吞噬体成熟和识别自身细胞与异物抗原蛋白的关键。与此相对，Yates和Russell用Pam3Cys-Ser-(Lys)4或脂多糖刺激骨髓中的巨噬细胞，可证明吞噬体的成熟独立于TLR2和TLR4的刺激。尽管在上面体外系统实验中的记录结果有很大的不同，但在我们的试验中IL-4是肥大细胞活化的主要成分。我们先前的研究证实骨髓衍生的巨噬细胞对土拉弗朗西斯菌感染高度耐受；然而，当其与肥大细胞共培养或添加rIL-4可显著的减少病菌的复制。重要的是，我们发现骨髓中的巨噬细胞在感染过程中不能产生IL-4，与此不同的是，骨髓中的肥大细胞则可产生。我们还有证据显示在肥大细胞和巨噬细胞共培养物中，肥大细胞产生的IL-4产物可以促进巨噬细胞增加ATP产物和随后的吞噬体酸化。因此，Yates和Russell实验结果与此不同，可能是片面的归因于巨噬细胞缺乏IL-4产物。

以前的研究表明IFN-r和TNF-a是在土拉弗朗西斯菌感染过程中主要的控制机制。然而，在肥大细胞中添加IFN-r可提升对活的疫苗株的杀伤，并增加IL-4 的产生；TNF-a不能充分诱导肥大细胞对土拉弗朗西斯菌的杀伤，如同TLR2阴性肥大细胞多表现的一样，这种结果与野生型肥大细胞有相似的水平。尽管TNF-a诱导的活性氧被证实可以促进信号介导的IL-4受体途径，但IL-4信号的启动不需要TNF-a。IL-4可增加ATP产物、促进组织蛋白酶L活化并使吞噬体酸化。此外，我们发现，TLR2信号是肥大细胞感应IL-4分泌物、最佳的组织蛋白酶L的活化以及吞噬体的成熟所必需的，这就导致LAMP2和MHCII分子定位于土拉

弗朗西斯菌。以前就应经证明，当受到金黄色葡萄球菌的肽聚糖刺激野生型和TLR4阴性的骨髓肥大细胞都可产生相同水平的TNF-a和IL-4。而相同的刺激则不能使TLR2阴性肥大细胞产生任何细胞因子。这与我们观察到的土拉弗朗西斯菌感染的TLR2阴性肥大细胞缺乏IL-4 的现象相一致。在TLR2阴性肥大细胞中观察到的TNF-a产物可能是其他TLRs 包括TLR4诱导的结果。重要的是，有报道称TLR2信号与自吞噬的吞噬作用和酸化的需要相联系。至此，Heuser开创性的工作显示胞内环境的酸碱度可影响溶酶体沿微管的转运。我们的发现显示，组织蛋白酶L的活性以如动力蛋白和肌动蛋白等涉及转运的多个胞内蛋白作为目标，同时在某种意义上展现出对杀伤土拉弗朗西斯菌上可促进吞噬体和溶酶体的有效转运与成熟，当过度表达时可促进细胞凋亡并出现组织坏死。另外，TLR2信号已经被证实对抑制肺结核杆菌也有重要的作用。对结核杆菌的有效抑制也可能有赖于为TLR9结构的改变和随后的发挥功能而产生的酸化。在这个研究中报告的结果支持在TLR2信号与为TLR9发挥功能产生的酸化有一定的联系。

早期的TLR2信号和吞噬体的成熟时肥大细胞有效杀伤细菌的关键，这个研究为探索抑制胞内的细菌病原体增殖开辟了新的道路。TLR2信号和IL-4产物导致早期增强活性组织蛋白酶L的水平，这对恒定链的裂解非常重要。另外，IL-4与组织蛋白酶B和S有所联系，这可能涉及癌症的发展，然而细胞外的组织蛋白酶L与细胞凋亡、组织损伤以及肿瘤的发生有关。通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察发现感染活的疫苗株一小时后的TLR2阴性肥大细胞表现比野生型更高活性的组织蛋白酶L。共聚焦显微镜分析还显示TLR2阴性肥大细胞质膜的瓦解以及释放活的疫苗株。在TLR2阴性的肥大细胞膜上LAMP2和组织蛋白酶L的强阳性区域，存在大量的荧光黄标记的活的疫苗株和几乎不可见的c-Kit蛋白，这表明溶酶体都定位在细胞膜上并使胞膜的完整性遭到破坏。为此，这在以前就被证明，溶酶体局限在质膜上是为了修复磷脂酰丝氨酸转移到质膜外的初始转运的过程。钙离子和肌动蛋白的聚合是这一过程多必须的，并且细菌可能通过这一过程逸出细胞外，是肥大细胞TLR2严谨规律所必需的展示。总之，这项研究证明了更深刻的肥大细胞介导的天然免疫机制和在革兰氏阴性菌感染肺部的过程中这类细胞的主要作用。