马钱子含药血清的制备与鉴定

　　[关键词]马前子；含药血清；制备；鉴定 　　[中图分类号]R285 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）10（a）-087-02 　　 　　马钱子，始载于《本草纲目》，其味苦性温，有大毒，入肝经，善于活血散结，通络止痛，它具有兴奋中枢、脊神经以及增强横纹肌、平滑肌、心肌的肌力与强筋骨，利关节，通经脉等功效[1]。在临床上常用于痹证、痿证等治疗。笔者发现马钱子在保护软骨上起有一定的药效学作用。为了进一步深入研究马钱子对体外培养的软骨细胞保护作用，本实验着重进行马钱子含药血清的制备与鉴定。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1试剂及药品 　　马钱子碱、士的宁购于中国药品生物制品检定所(06-9403)均为20 mg/支；马钱子制剂由河南省中医院中药库提供；苯，上海东懿化学试剂厂(2002201)，分析纯；乙酸乙酯，华东师范大学化工厂(19991112)，分析纯；二乙胺，中国医药上海化学试剂公司(20020702)；硅胶，G薄层板(200 mm×200 mm)，青岛海洋化工厂。 　　1.2动物 　　新西兰兔4只，体重2.0～2.5 kg左右，由河南省动物实验中心提供。 　　1.3马钱子含药血清的制备 　　取健康新西兰兔4只，分成2组，为马钱子药物组和空白对照组，每组2只，体重在2.25 kg左右。马钱子组按马钱子100 mg/kg剂量配成溶液灌胃，空白对照组按2 ml/kg生理盐水配成溶液灌胃，1 次/d，均连续给药3 d，末次灌药2 h后，硫喷妥钠麻醉后，无菌条件下于腹主动脉下取血，离心后，取血清，过滤后，经56℃30 min灭活处理后，备用。试验时用培养液配成20％，10％，5％的含药血清作为马钱子高、中、低剂量的含药血清。 　　1.4马钱子含药血清中成分使用薄层层析法鉴定 　　取200 mm×200 mm硅胶G板105℃活化1 h，置干燥器中冷却备用。分别取马钱子含药血清、空白兔血清各5 ml，分别加甲醇50 ml，超声提取0.5 h，分别过滤，滤液蒸干后分别加0.5 ml甲醇溶解，即得含药样本和不含药样本(备点样用)。对照品溶液的配制：取马钱子碱、士的宁对照品各约l mg，分别加甲醇2 ml溶解，得马钱子碱对照品溶液、士的宁对照品溶液各1份(备点样用)。活化的硅胶板取4个点样：马钱子碱对照品、士的宁对照品、马钱子含药血清样品、空白兔血清样品，加入20 ml展开剂为苯、乙酸乙酯、二乙胺(1∶2∶0.05)，展距为15 cm，展开后取出，晾干，以稀碘化铋钾试液显色。稀碘化铋钾试液按2000年版药典配制。 　　 　　2 结果 　　 　　马钱子含药血清中成分的鉴定结果：马钱子碱对照品原点上方和士的宁对照品原点上方各显现出1个桔黄色斑点(Rf马＝0.29；Rf士＝0.44)，马钱子含药血清原点上方在对照品相应的位置上显现出2个相同的桔黄色斑点，而空白兔血清则无桔黄色斑点显示，这表明马钱子含药血清中含有马钱子碱和士的宁成分。 　　 　　3 讨论 　　 　　顽痹的成因，多由风寒湿邪阻滞络脉，日久不解，痰瘀搏结所致。常规药物往往力所不及。中药马钱子药性峻猛，善钻筋透骨，活络搜风，散结止痛，其开通经络、透达关节之功远胜他药。马钱子既有通络止痛作用，又有强筋壮骨功效，能行能补，配伍可寒可热、一药多能[2]，是临床治疗骨关节炎之要药。目前中药成方治疗骨关节炎有较好疗效的多含有马钱子，如中成药马钱子散、伤科七味片、益髓冲剂，腰痛宁等。笔者发现马钱子在保护软骨上有一定药效学作用。因此，有必要进一步探讨马钱子对骨关节炎作用机制。为了深入研究马钱子对体外培养的软骨细胞保护作用，本实验着重进行马钱子含药血清的制备，并对血清中成分进行鉴定。 　　实验中，笔者运用血清药理学的方法观察马钱子的药学作用，即通过给成年新西兰兔灌服一定量马钱子，采用的马钱子为炮制品，毒性已大大降低，马钱子具体剂量参照中华人民共和国卫生部药典委员会主编的《中华人民共和国药典(一部)》[3]，药典规定马钱子剂量为0.3～0.6 g/d，笔者在实验中设计马钱子剂量为0.5 g/d，新西兰兔用药剂量根据动物与人体的每千克体重剂量折算。进行代谢后，取其马钱子含药血清，配制成不同浓度，加入软骨细胞体外培养体系中进行试验。因为中药多数是通过口服而起作用的，而用中药粗制剂如马钱子直接加入人离体反应体系中进行实验研究在方法学上存在很多问题。由于中药存在不少杂质成分，各种电解质或鞣质成分，以及不同酸碱度的影响等，都会对其生理活性造成一定的假象，从而影响体外实验结果的正确性。运用血清药理学的研究方法，以含药血清进行体外实验，可以排除以上各种干扰因素的影响，比较接近药物体内环境中产生药理效应的过程；同时，含药血清可以避免体外实验因药物体内代谢过程而得出的错误结论[4]。运用马钱子含药血清培养软骨细胞更接近体内，更能反映出马钱子的作用。目前血清药理学还存在如血清采集时间、含药血清浓度测定等争议。笔者采用较通行的办法，即连续给药3 d，末次给药后2 h采血，2 000 rpm，20 min离心，56℃，30 min灭活[5]。笔者同时对马钱子含药血清中主要成分进行鉴定，目前认为马钱子中主要成分有马钱子碱、士的宁等，笔者根据文献所述方法[6]将马钱子含药血清与对照品马钱子碱和士的宁比较，马钱子含药血清在相应的位置上显现出2个相同的桔黄色斑点，而空白兔血清则无桔黄色斑点显示，这表明马钱子含药血清中含有马钱子碱和士的宁成分，而空白兔血清则无马钱子碱和士的宁成分。通过本实验，笔者对马钱子含药血清定性鉴定作了一些探索，而马钱子含药血清定量测定，则有待于大家今后进一步研究。 　　 　　[参考文献] 　　[1]刘青云.中药药理学[MJ.北京:人民卫生出版社,1997.124. 　　[2]周翠英,孙素年,傅新利.风湿病中西医诊疗学[M].北京:中国中医药出版社,1998.233. 　　[3]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2000.38. 　　[4]阴赫宏，李兰芳，金亚宏,等.中药含药血清药理与在体药效相关性的初步观察[J].中国中医药信息杂志，1999，6(10)：35. 　　[5]孟李，王宁生.含药血清的制备方法研究[J].中药新药与临床药理,1999,10(5):290-292. 　　[6]杨勤建.化痰散结方含药血清诱导人肺癌细胞凋亡的机理研究[J].北京中医药大学学报,1999,22(5):70-72. 　　（收稿日期：2007-07-26）