单克隆抗体纯化的研究进展
单克隆抗体纯化的研究进展
唐佳佳, 李小兵, 刘国文, 孔涛, 刘磊, 杨威, 王哲
(吉林大学畜牧兽医学院, 吉林长春 130062)
摘要:单克隆抗体在现代生物检测领域和医疗领域起着越来越重要的作用。而不管是何种抗体, 来源于哪种形式, 在用于检测和治疗之前都需进行纯化, 纯化的方法因抗体种类和用途不同而不同。大致可分为沉淀法和色谱法两大类, 作者就各种不同方法的应用范围及纯化结果的纯度、活性回收率、纯化周期、每批可纯化样品量、纯化成本等方面进行了比较和讨论。
关键词:单克隆抗体; 纯化; 沉淀技术; 色谱技术
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2011) 02-0076-04
抗体是一种功能多样的实验室必备检测试剂, 如免疫组化、免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(ELISA) 等都要用到抗体。单克隆抗体主要来源于杂交瘤细胞培养上清和免疫动物的腹水, 不论抗体是何种形式的来源, 在使用之前都应进行纯化。单克隆抗体的纯化方法大致可分为沉淀法和色谱法两大类, 沉淀法一般操作简单, 省时省力, 回收率高, 但纯度有限; 色谱法相对而言操作较繁琐, 但是所获抗体纯度较高, 可以满足精密试验对抗体的需要。所以应根据需要来选择抗体纯化的方法。1 沉淀技术
沉淀技术的原理是不同蛋白质其疏水性不同, 而提高盐浓度时, 其疏水性会增加, 使蛋白质沉淀而分离。目前常用的沉淀技术主要有硫酸铵(AS) 沉淀法、辛酸(CA ) 沉淀法、辛酸硫酸铵法(CA -AS) 沉淀法、优球蛋白沉淀法、聚乙二醇(PEG) 沉淀法5种。
1. 1 AS 沉淀法 AS 沉淀法是根据免疫球蛋白在30%~50%饱和硫酸铵浓度范围内会形成沉淀而与其它蛋白质杂质分离而设计的; 该方法具有可稳定抗体、去除大部分白蛋白和转铁蛋白、抗体活性损失小、样品可以被浓缩等优点, 但是纯度不高, 需要结合其它方法进一步纯化, 该方法适用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化各种不同类型的抗体。在采
收稿日期:2010-08-12
作者简介:唐佳佳(1987-) , 女, 湖南人, 硕士, 研究方向:动物营
养代谢病。
通信作者:王哲(1950-) , 男, 吉林人, 教授, 博导, 从事动物营养
代谢病与中毒病研究。E -mail:w an gzhe500518@so -hu. com
基金项目:国家/8630资助项目(2007AA10Z440; 2007AA10Z426) 。
用, AS 沉淀时需注意两点:¹某些mAb 经AS 沉淀后抗体的活性会有所降低或丧失; º在采用AS 固体进行沉淀时, 局部的浓度过高会引起其它杂蛋白的共沉淀而影响抗体的纯度。
1. 2 CA 沉淀法 CA 沉淀法的原理是一定浓度的CA 可以使腹水中B 和A 球蛋白、白蛋白等杂蛋白沉淀下来, 使抗体保留于上清液中而得以分离; 该方法的优点是可以减少抗体聚合, 保持抗体活性; 缺点是抗体不被浓缩, 需利用超滤或硫酸铵作进一步浓缩, 回收率低。该技术适用于IgG1、Ig G2a 、Ig G2b 和Ig M 亚类的纯化, 而对于IgG3及IgA 类抗体辛酸会使它们产生不可逆沉淀而使抗体失活。
1. 3 CA -AS 联合沉淀技术 CA -AS 法可以在偏酸条件下沉淀血清或腹水中除Ig G 外的蛋白质, 适合于提纯IgG1和IgG2b, 不能用于Ig M 和IgA 的纯化; 该方法操作简单方便, 抗体回收率和产率均高, 抗体活性损失小。周玉等(2006) 分别采用CA -AS 、AS 和DEAE 离子交换层析法对小鼠腹水Ig G 进行了纯化效果的比较, 结果表明, CA -A S 法提取Ig G 的纯度为67. 5%, 高于AS 法(43. 2%) , 低于DEAE 法(100%) ; CA -AS 法提取IgG 的回收率为51. 2%, 远高于DEAE (8. 9%) , 略低于AS 法(63. 8%) , 而通过ELISA 法进行的抗体活性研究结果表明, CA -AS 法优于AS 法。
1. 4 优球蛋白沉淀法 优球蛋白沉淀法适用于Ig G3和IgM 型单抗的提取, 1988年, Gar cia -Gor-i zalez 调查发现, 用该法纯化的抗体活性几乎保持不变, 对IgG3单抗的回收率高于90%, 对IgM 单抗的回收率为40%~90%。
1. 5 聚乙二醇(PEG) 沉淀法 PEG 沉淀法原理:PEG 具有强极性, 产生极强的亲水性, 夺取水分子,
导致抗体分子析出; 该方法常用于IgM 的纯化, PGE 沉淀可使IgM 达到较高的纯度(大于90%) 和回收率(大于80%) ; Ig G 回收率较高(大于70%) , 但纯度较低(30%~40%) , 通常需加一步阴离子交换层析来提高抗体的纯度。2 色谱技术
色谱技术(Chro mato graphy ) 又称层析技术, 利用混合物各组分理化性质上的差异, 如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小和亲和力等, 使各组分以不同程度分布在2个相中, 其中一个为固定相, 另一个为流动相, 当混合物随流动相通过固定相时, 由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同, 而使各组分移动速度各异, 以达到分离的目的。2. 1 离子交换色谱法 离子交换色谱法(ion ex -chang e chro matography , IEC) 纯化抗体的原理是根据抗体蛋白在不同pH 条件下所带电荷不同, 分别与带相反电荷的介质表面结合后, 通过改变洗脱液的pH 或盐离子浓度而将其洗脱下来, 从而与杂蛋白分离的一种色谱法。阴、阳离子交换剂都可以用于抗体的纯化。阴离子交换层析(catio n -ex change chr omatogr aphy, CEX) 主要采用吸附) 洗脱模式, 由于DNA 、宿主细胞蛋白质、脱落的Pro tein A 配基和内毒素均带负电, 与阳离子介质结合力弱而被除去。CEX 主要适用于纯化IgG 。Zhou 等采用CEX 法, 用pH -离子强度混合梯度洗脱模式纯化单抗, 以乙酸钠溶液130(pH 5. 0) ~190mm ol/L (pH 6. 0) 2梯度洗脱, 单抗的纯度为99. 56%, 回收率为98. 6%, 抗体浓度高(9mg/mL) 。阳离子交换层析(anion -exchange chromatog raphy, AEX) 主要采用穿流模式, 即杂质保留在柱上, 而目标抗体穿过层析柱, 可以在低pH 条件下去除病毒及DN A 杂质, Andreas 等采用AEX 法, 以Fr actogel EM D SO 3
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其优点有选择性好, 一步纯化所得抗体的纯度大于99%; 可浓缩抗体, 洗脱液的抗体浓度大于10g/L; 可有效灭活病毒; 适用于所有人源的(非Ig G3) 抗体和Fc 融合蛋白, 减少缓冲液的种类和用量; 该方法
是目前应用最普遍的单克隆抗体纯化方法之一。但由于Protein A 是具有生物活性的物质, Chen 等(2008) 发现Pro tein A 层析与传统化学配基相比也存在一些问题:Protein A 凝胶价格昂贵, 是普通色谱介质的10倍; 抗体在低pH 条件下洗脱, 易形成高分子聚合物和沉淀; 脱落的Protein A 配基会与抗体一起被洗脱, 影响抗体的安全性; 层析使用周期短; 易被存在样品中的蛋白酶水解, 从而降低分离效果; 缺乏有效的清洗方法, 由于在碱性环境下不稳定, 因此不能用一般的氢氧化钠原位法清洗。针对这些问题, 近几年也研发很多改进型的Pr otein A 色谱, 如GE 公司生产的M abSelect -SuRe, 该层析法更加耐碱且配基脱落率低。由于至今仍然无法克服Pro tein A 配基脱落及价格昂贵的问题, 许多研究者都在寻找Protein A 的替代品。
2. 3 Protein G 亲和色谱 Protein G 是一种从链球菌中提取的细菌细胞壁蛋白, Pr otein G 不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合, 且与白蛋白、A 2-巨球蛋白相结合, 这使得用Pro tein G 亲和色谱提纯抗体, 无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前, 采用基因修饰的方法表达出来的Pr otein G 可以克服上述缺点。
2. 4 免疫亲和色谱 免疫亲和色谱是根据抗原和抗体结合形成特异性抗原) 抗体复合物的特性而设计的。将可溶性抗原偶联到不溶性介质上, 使之固定化, 并填装入适宜的层析柱中, 将含相应抗体的样品加入柱中, 抗体与抗原特异性结合, 其他蛋白质组分流出。改变缓冲液的pH 和离子强度, 就可以使抗体和偶联在介质上的抗原分开而被洗脱下来, 从而得到纯净的抗体。免疫亲和色谱法是分离抗体非常有效的方法, 但由于抗原是一种昂贵的生物活性物质, 限制了该方法的大规模使用。
2. 5 组氨酸亲和色谱 组氨酸的性质比较独特, 具有弱疏水性、咪唑环为弱电性, 可与许多种蛋白质发生亲和作用。将组氨酸通过己胺基键合在琼脂糖凝胶上时, 组氨酸与IgG 的结合常数Ka 为4. 2@105L/mol, 符合亲和层析的要求, 常用于纯化IgG, Yakup 等(2004) 用该法纯化IgG, 效果较好。由于组氨酸不需要特殊的三级结构来维持生物活性, 因此较一般的蛋白层析来说更加稳定, 是一种简单、有
(M ) 和Fractog el EM D SE H icap (M ) 为阳离子交
换剂对其纯化抗体条件进行了摸索, 结果发现, 在一定合适pH 抗体回收率分别为98%和95%, 但在低pH 洗脱条件下, 该方法易引起抗体的失活。此外, 阴阳双层交换离子法也可用于抗体的纯化。
2. 2 Protein A 亲和色谱 Protein A 是金黄葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分, 它是单一的多肽链, 分子质量为42000u, 分为5个片段, 每个片段都具有和Ig G 的Fc 片段结合的活性。Pro tein A 能与大部分哺乳动物的IgG 反应, 不同属种的抗体对Pro -tein A 的亲和力不同。因此, 据此可将Pr otein A 作为配基结合在各种软凝胶上用于分离IgG 亚类。
效、方便、廉价的分离纯化IgG 的方法, 但是其特异性选择性不高。
2. 6 羟基磷灰石(H AT 或H T ) 色谱法 羟基磷灰石[Ca 5(PO 4) 3OH ]是一种磷酸钙结晶, 表面有许多带正电荷的Ca 离子和带负电荷的PO 4离子, 还有可形成氢键的OH 基团。其特点是不能与小分子结合, 能与带电荷的生物高分子结合, 这种结合具有很强的亲和力, 常可在高盐浓度或有去污剂、变性剂存在的条件下结合, 被结合的高分子又可在接近中性的条件下通过磷酸盐的浓度梯度被洗脱。因此用于抗体的纯化, 常能达到其他层析材料所不能达到的分离效果。血清蛋白中的抗体蛋白与H AT 结合力最强, 用pH 6. 8, 10~300mmo l/L 磷酸钠缓冲液梯度洗脱, 小鼠腹水中的Ig G 或IgM 均为最后洗脱峰, 纯度可达90%以上。由于洗脱条件接近生理条件, 所得纯化M cAb 的活性也较高。
2. 7 凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱(gel filtr ation chr omatogr aphy, GFC) 是利用凝胶粒子为固定相, 根据样品中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。由于抗体与杂质蛋白的分子质量差别较大, 实际纯化中可以用GFC 来纯化抗体。其缺点是样品处理量小; 而其原理仅为空间排阻效应, 对于分子质量接近的蛋白质分子分离能力较弱, 需与其它方法联合使用。
2. 8 疏水作用色谱 疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatog raphy, H IC) 以蛋白质表面偶联疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相, 根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。抗体分子表面有许多非极性氨基酸, 它们密集在一起形成疏水区, 因此抗体分子也能用疏水作用色谱进行纯化。但是由于不同疏水区与不同盐浓度结合和洗脱的条件不同, 因此对纯化条件需进行仔细优化; 另外H IC 对白蛋白有较强吸附作用, 通常需与其它分离方法联合使用。
2. 9 疏水电荷诱导色谱 疏水电荷诱导色谱(hy -dro phobic char ge induction chrom ato graphy, H CIC) 是20世纪90年代末期由Burton 和H ar -ding 提出并命名的一种纯化技术, 其原理是由具有pH 依赖行为的双模式、可离子化的配基(如吡啶) 所决定的, 在pH 6~9的中性及微碱性范围内配基是不带电的, 表现出疏水的特性而与疏水性较强的蛋白相结合, 当流动相的pH 下降到一定范围后, 配基和蛋白质都带有正电荷, 由于同相电荷的排斥作
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用, 蛋白质便被洗脱下来而得以分离。H CIC 在抗体纯化方面具有许多优点:原样品可以不经处理直接纯化; 价格相对便宜; 洗脱条件温和; 纯化效果好。很多研究者认为是一种理想的可取代Protein A 和
Pro tein G 亲和层析的抗体纯化方法。Boschetti 等(2002) 研究了其对于不同来源抗体的纯化效果, 抗体纯度高达98%。而Sanchay ita 等(2006) 经调查也表明, 经H CIC 纯化的抗体用SDS -PAGE 法检测, 其纯度为75%~99%。Chen 等(2008) 报道了以巯基乙基叱咤树脂(mercapto -Ethy-l pyr idine, MEP) 为固定相, 用H CIC 纯化单克隆抗体, 与传统的H IC 相比, H CIC 能大幅提高单克隆抗体纯化的效率。
2. 10 固定化金属离子亲和色谱(IM AC) IMAC 利用样品中暴露的蛋白质残基(组氨酸、赖氨酸、色氨酸等) 和固定于介质上的金属离子(铜、锌、钻、镍等) 之间的相互作用不同的原理而将蛋白质进行分离; 该方法尤其适用于抗体的纯化, 因为它具有以下优点:配基简单且高度稳定、吸附量大、分离条件温和。H ar i 和M arecek 分别于2000年和2004年采用该方法对Ig G 进行了纯化; 但该方法要求所纯化的抗体蛋白有组氨酸、赖氨酸等能与金属离子进行结合的氨基酸残基。
2. 11 亲硫吸附色谱 亲硫吸附色谱(thiophilic adso rption chrom ato graphy, T AC) 是利用固定相表面所含的硫官能团与蛋白质含硫部分相互作用的原理而设计的层析法, 在单克隆抗体的纯化中也得到了应用。其优点有容量大、纯化快速、柱稳定性好、通用性强, 适用于各种不同的种属、不同类型及亚类的单克隆抗纯化。N oper 等以硅胶为亲硫吸附剂基质, 纯化了大鼠和小鼠的不同亚类的单克隆抗体, 纯化时间仅为10min, 每克固定相的容量为20mg 蛋白质, 柱稳定性好, 不同样品300次操作后柱效无明显改变, 但小鼠Ig M 与固定相的吸附较弱; 认为该方法有可能取代Protein A 和Protein G 色谱, 成为抗体纯化的一种通用方法。3 其它方法
3. 1 沸石法 沸石法(zeolite) 是一种铝矽酸盐结晶物质, 其化学式为Na x [(AlO 2) x (SiO 2) y ]#2H 2O 。钠离子、钾离子、铵离子等阳离子及带电的蛋白质在带负电的沸石多孔结构内能处于平衡状态, 其纯化抗体的原理与阳离子交换层析相似, 因为沸石本身也是一种阳离子交换剂, 所以当蛋白质的等电点高于缓冲液中pH 时, 蛋白质就会吸附到带
负电荷的沸石结构内, 然后用高浓度的盐与蛋白质竞争阳离子结合位点, 而使蛋白质分离。沸石有很高的机械强度, 不会有干缩湿胀反应, 能在高温下灭菌, 能快速处理大量蛋白质样品而对流速没有限制, 缓冲平衡时间及再生时间短, 便宜。H uang 等(1998) 采用Zeolite A 法, 分别用钠离子、钾离子、铵离子为阳离子交换剂对小鼠腹水等生物样品进行纯化, 其中钾离子Zeolite A 纯化效果最好。
3. 2 非层析抗原特异性吸附法 非层析抗原特异性吸附法的原理为抗原抗体特异性吸附, 但与免疫亲和层析法不同, 它是一种非层析技术。它通过将目标抗体与具有多个抗体结合位点的抗原形成二聚体、三聚体或多聚体环状物, 然后根据分子质量的不同用化学方法使环状物沉淀, 最后将抗体释放而使抗体纯化。与层析法相比该方法具有以下优点:¹纯化出来的抗体具有2个Fab 结合位点, 所以抗体活性强; º该法操作简便、快速、廉价; »该法产量高, 纯度高。Basar 等(2009) 首次使用该方法对小鼠腹水IgGDNP 和IgGDg n 进行纯化, 其产量均高于80%, 纯度大于95%; 但是该方法也有一个缺陷, 即抗原必需具有多个抗体结合位点。
3. 3 组合法 不同纯化方法的组合及不同的操作顺序均会影响抗体的纯化, 合理的组合会大大提高抗体的纯度和产量。马乱冰等采用IM AC 和GFC 两步串联纯化鼠抗人CD28单抗2F5, 结果显示抗体纯度大于90%, 总回收率为70%, 纯化的单抗在体外对人外周血T 细胞(peripheral blood T cells, PBT C) 具有明显的促增殖作用, 表明抗体活性良好。Ishihara 等采用Protein A 亲和色谱-AEX -CEX 三步法纯化人源性单抗(hmAbs) , 并根据其氨基酸序列预测色谱的洗脱条件, 包括Pr otein A 亲和色谱的洗脱pH 、AEX 的流动相pH 和CEX 的洗脱盐浓度, 结果hmAbs 的纯度为97%~99%。陈华等(2006) 用盐析与疏水电荷诱导层析相结合的方法纯化单克隆抗体, 其抗体纯度大于90%, 总回收率为65%, 生物活性好。4 结语
上述介绍的各种方法是目前对抗体纯化较成熟且较为常用的方法, 可根据不同的目的和试验条件, 采用比较合适的方法对所制备的单克隆抗体进行纯化。单克隆抗体在生物学和医学领域的应用越来越广, 寻找和研究更为有效的单克隆抗体纯化方法有助于将抗体应用于多科学研究中, 从而推动生物医学和生命科学向前发展。
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蛋鸡骨骼肌卫星细胞分离培养及鉴定
郑素月1, 樊宝良1, 2, 张庆桥1
(1. 河北工程大学农学院, 河北邯郸 056038; 2. 河北农业大学动物科技学院, 河北保定 071001)
摘要:采用组织块分离法从蛋鸡鸡胚腿部肌肉组织中体外培养获取鸡骨骼肌卫星细胞, 对培养的细胞进行了传代、冻存和复苏研究, 同时从分子表达水平对分离培养的卫星细胞进行了鉴定, 建立了一套鸡骨骼肌卫星细胞分离、传代、冻存和复苏的方法。特异基因表达鉴定结果表明, 该方法分离得到的细胞能够表达卫星细胞特异的标志基因P ax 7, 而肌细胞分化基因M y oD 、M y ogenin 未表达, 说明获得的肌卫星细胞纯度较高, 尚未进行肌细胞的分化。
关键词:蛋鸡; 骨骼肌; 卫星细胞; 培养; 鉴定
中图分类号:Q813 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2011) 02-0080-04
骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性干细胞, 负责骨骼肌的生长和骨骼肌的损伤修复。最早于1961年由Mauro 在蛙骨骼肌中发现。Bischoff(1975) 首次从大鼠骨骼肌中分离出来并进行体外培养。此后, 随着对其研究的不断深入, 人们逐渐认识到卫星细胞具有使受损肌肉再生的潜能。肌卫星细胞作为组织工程的种子细胞用于修复瘫痪的肌肉, 对恢复肌肉的动力功能有广阔的前景和应用价值(Dasar -athy 等, 2004) 。目前, 卫星细胞已从吐绶鸡、羊、牛、猪、狗及人的骨骼肌中也相继分离出来, 但在蛋鸡的骨骼肌中分离报道较少。本研究采用组织分离
收稿日期:2010-08-12
作者简介:郑素月(1969-) , 女, 河北人, 副教授, 博士, 从事微生
物与生物技术研究。
通信作者:樊宝良(1966-) , 男, 河北人, 教授, 博士, 从事动物遗
传与育种研究。E -mail:fan b1119@vip. sina. com
基金项目:河北省自然科学基金(C2008000713) ; 国家863计划
项目(2007AA100504) 。
法培养了大量优质的鸡骨骼肌卫星细胞, 并进行了传代、冻存和复苏, 同时从分子表达水平对鸡骨骼肌卫星细胞进行了鉴定, 建立了一套较完备、快速的鸡骨骼肌卫星细胞的培养和鉴定方法, 旨在为鸡骨骼肌卫星细胞的进一步应用研究及该卫星细胞系的建立奠定基础。1 材料与方法1. 1 材料及试剂
1. 1. 1 鸡胚 18胚龄SPF 蛋鸡种蛋, 品种为大午京白939, 购自河北某种禽有限公司。
1. 1. 2 试剂 T ransZol Up 试剂盒和反转录TransScript
TM
Two -Step RT -PCR SuperMix (TRANS)
试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司; 去除基因组DNA 试剂购自宝生物工程(大连) 有限公司; PCR 扩增试剂购自天根生化科技(北京) 有限公司; 细胞培养用DMEM 和胎牛血清购自美国GIBCO 公司。1. 2 方法
1. 2. 1 鸡卫星细胞的分离和培养 取18日胚龄大
Progresses on Purification of Monoclonal Antibody
TANG Jia -jia, LI Xiao -bing, LIU Guo -w en, KONG Tao, LIU Lei, YANG Wei, WANG Zhe
(Animal Science and V eter ina ry M edicine Colleg e o f Jilin U niv ersity , Chang chun 130062, China)
Abstract:M onoclo nal antibody play an impo rtant ro le in the f ields of modern bioinstrumentation and medical tr eat. Reg ard -less of the subty pes and the forms of sauce, any antibody should be purified befo re being used t o detect and therapy. T he meth -ods of pur ification are different by the kinds and purpose of antibodies. T hey can be div ided into tw o ty pes, sediment ation and chromat og raphy. T his paper r eview these methods by the range of applicat ion, purit y of o ut put, coefficient o f recover y, cycle of purification, batch of samples and cost.
Key words:monoclonal antibody; pur ificatio n; sedimentation; chromat og raphy