碱裂解法提取质粒DNA的研究1
第28卷第3期遵 义 医 学 院 学 报Vol.28No.3
2005年6月ACTAACADEMIAEMEDICINAEZUNYI Jun.
2005
碱裂解法提取质粒DNA的研究
周鹤峰,邵 敏,葛正龙
563003)
[摘 要] 目的 对碱裂解法提取质粒DNA方法、溶液Ⅱ、溶
1
2
2
(1.遵义医学院珠海校区生物工程教研室,广东珠海 519041;2.遵义医学院生物化学教研室,贵州遵义
液Ⅲ分别进行质粒DNA的提取。结果4DNA含蛋白质较多。结论 溶液Ⅰ,ⅡDNA量的多少,溶液Ⅲ中的醋酸钾。
[关键词] ;[中图分类号]Q78 [文献标识码]A [文章编号] 100022715(2005)0320225203
StudyonthealkalinelysismethodofextractingplasmidDNA
ZHOUHe2feng,SHAOMin,GEZheng2long
1
2
2
(1.Departmentofbioengineering,ZhuhaiCampus,ZunyiMedicalCollege,GuangdongZhu2hai5190412.DepartmentofBiochemistry,ZunyiMedicalCollege,GuizhouZunyi563003,China)
[Abstract] Objective toexploretheactionofmainreagentalkalinelysismethodofextractingplasmidDNA.Methods
adoptdifferentSolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢtoextractDNAintheplasmid.Results thequantityofplasmidDNA
isobviouslydecreasingbymethodthree,theproteinoftheplasmidDNAismorethantheothermethodsbymethodfour.Conclusions solutionⅠhaslittleinfluencetotheexperimentresult,andNaOHinthesolutionⅡrelatestothequantityofextractingplasmidDNA,KAcintheSolutionⅢisoneoftheimportantfactorsintheprotein,spurification.[Keywords] plasmidDNA;extracting;alkalinelysismethod
质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独下。立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子,其分子量一般在0.2～10kD范围内。由于质粒分子小,便于分离和提取,可以携带目的基因进入细菌、动物
1 材料和方法
1.1 材料
α,菌细胞或植物体内进行扩增与表达。基因克隆实验中1.1.1 实验菌株 使用菌株为大肠杆菌DH5
L212基因。常将经改造后的质粒作为运送基因的载体,质粒D2株内含质粒pBI121,该质粒上克隆一hI
主要试剂 氨苄青霉素、RNaseA购自华美生NA提取效率及质量对后续实验步骤(如酶切、连接、1.1.2
DL2000核酸分子量标记购自转化大肠杆菌与PCR扩增等)的成功与否有着直接物工程公司;DL15000、
的关系,因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒TAKARA公司;其它各种常规化学试剂均为分析纯。
[1]
方法具有重要意义。目前从细菌中提取质粒DNA多采1.2
[1]
质粒DNA的提取 采用4种不同的方法用碱裂解法,该法操作简便,但若明确其中主要试剂1.2.1
挑取的作用,所提取的质粒DNA的纯度及质量会更高。进行质粒DNA的提取,所用具体试剂见表1:①
单菌落,接种于4.0mlLB(含氨苄青霉素)液体培养基笔者通过不同的试剂进行摸索,现将结果报告如
中,37℃、250rpm振荡培养过夜(约12～14h)。②取1.5ml培养物加入Eppendorf管中,室温12000g离心
μl预冷的溶1min,弃上清。③将细菌沉淀重悬于100[收稿日期]2005203209;[修回日期]2005204210
μl新液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀。④加200[基金项目]贵州省省长基金(NO1C2193)
[作者简介]周鹤峰(1980—),男,山东莱阳人,硕士。鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并
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遵 义 医 学 院 学 报 28卷
μl预冷的溶×将离心管放置于冰上2min。⑤加入1505min。⑧1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1～2
μlTE(含液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀冰上放置3min。⑥加次,沉淀在室温下晾干。⑨沉淀溶于50
μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心RNaseA20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分入45012000g×10min。⑦小心移出上清于一新Eppendorf子,-20℃保存备用。管中,加入2/3倍体积异丙醇,混匀,4℃离心12000g
表1 4种不同的方法进行质粒DNA的提取所用试剂组 别溶液Ⅰ溶液Ⅱ溶液Ⅲ
1
50mM葡萄糖,25mMTris2HCl(pH8.0), 10mMENaOH,1%SDS
2
3
,(.,EDTA(pH8.0)1%SDS
4
葡萄糖,25mMTris2HCl(pH8.0), 10mMEDTA(pH8.0)200mMNaOH,1%SDS
(4.8)醋酸钾(pH4.8)醋酸钾(pH4.8)醋酸钠(pH4.8)
1.2.2 质粒DNA的定量及杂质检测 各取样品的醋酸钾主要是与SDS(十二烷基硫酸钠)作用生成
μL释稀200倍后,分别测定OD260和OD280值,若10
OD260/OD280>2.0,表明DNA中含有RNA杂质。若OD260/OD280
[2]
PDS(十二烷基硫酸钾),从而使大部分蛋白质沉淀。
表2 不同方法提取的质粒DNA的吸光度
OD值
D260D
分别取
方法1
0.020
0.011
方法20.019
0.011
方法30.004
0.002
方法40.017
0.018
280
μL,进行酶切。反应体四种方法得到的质粒DNA1
D260
1.8201.7302.0000.944μl,在0.5mlEppendorf管中依次加入ddH2O,系为20μg质粒DNA,限制性内2.2 10×酶切反应缓冲液,BSA,1
质粒DNA经smaI单酶切后电泳检测 采用四
μl,于37℃酶切2h,加适当loading种不同的方法抽提质粒pBI121
(其片段大小为1.5k2切酶SmaⅠ0.5
buffer混匀上样,在0.8%琼脂糖凝胶上电泳,采用b),分别用smaI37℃酶切2h,琼脂糖凝胶电泳,通过5V/cm的电压,电泳3h,EB染色,取出凝胶置紫外灯电泳图可以看到:方法3得到质粒DNA的量明显偏下检测,拍照。少,表明裂解细菌主要试剂是NaOH,而不是SDS,若1.2.4 PCR扩增hIL-12特异片段 引物为一对能只用SDS也能抽提得到少量质粒DNA,见图1。够扩增1613bp的hIL-12基因的特异性引物:①上游引物5’-TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACC
AGCA-3’;②下游引物5’-ACCGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG-3’。分别取4种方法提
取的质粒DNA为模板进行PCR扩增反应,PCR反应
μL混匀后在下列循环参数下进行扩增:体系为20
94℃5min,
图1 四种方法得到的质粒DNA经smaI单酶切后电
μLPCR扩增产物和1μL溴酚兰上泳图72℃6min。取4
样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,电压4V/cm,电泳2h。
[3]
(1,2,3,4:分别用方法1,2,3,4所提取的质粒pBI121;M:DL15000Marker)
2.3 PCR扩增hIL-12特异片段 四种方法提取的
质粒DNA扩增hIL-12,其基因片段大小为1613bp,方法4提到的质粒没有扩增出hIL-12,说明此法所
2.1 质粒DNA的定量及杂质检测 表2结果显示:
提取的质粒DNA含蛋白质较多,见图2。
是否使用溶液Ⅰ对实验基本上没有影响,溶液Ⅱ中的
2 结果
NaOH直接关系到所提取质粒DNA的量,溶液
Ⅲ中
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周鹤峰等・碱裂解法提取质粒DNA的研究
性。这一步操作要注意两点:一是,放置时间不能过
长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢
[5]
慢断裂。二是,混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。加入溶液Ⅲ后,会有大量的沉淀生成,这是由于要SDS与蛋白质结合后,SDS与醋酸钾生成了PDS,PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了,所得到的沉淀
[4]
。
图2 四种方法提取的质粒DNAPCR扩增结果电泳图
(1,2,3,4:分别用方法1,2,3,4所提取的质粒pBI:DL2000Marker)
]Sambrook,Russell编著.分子克隆实验指南
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qualityplasmidDNAbyacombinationofmodifiedalkalinelysisandsilicamatrix[J].AnalBiochem,1999,272(1):1092112.
[责任编辑:王福军]
3 讨论
DNA的基本原理是溶液Ⅰ使
2+2+
细胞悬浮并且EDTA可以与Ca和Mg螯和,抑制DNase的活性,溶液II裂解细菌,变性蛋白质和少量质粒,溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一
[4]
起被共沉淀,质粒DNA复性。因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ,用LB液体培养基代替之也可以,只要在短时间内完成质粒的提取即可。
裂解细菌主要是溶液II中的NaOH,而不是SDS,所以叫碱裂解法,若只用SDS也能抽提得到少量质粒,这是因为SDS也是碱性的,但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外,NaOH若不是新配制的,可能会由于空气中的CO2与NaOH作用,减弱了其碱
甲状旁腺功能亢进症一例报告
刘惠双,高 琳,杨孟雪
(遵义医学院附属医院内分泌科,贵州遵义 563003)
1 病例介绍
患者,男,19岁,因双下肢疼痛1年半,加重伴明显畸形半年于2005年6月4日入院,患者于1年半前无明显诱因开始双下肢疼痛,于当地诊所口服钙片治疗无效。1年前骑摩托车摔伤右下肢,X线检查示:右胫骨中上段青枝骨折,于当地医院口服钙片及接骨丹治疗。近半年来双下肢疼痛加重自膝关节以
下渐出现外侧成角畸形,疼痛加重行走困难,口服钙2 讨论剂治疗无效。来我院门诊查全段甲状旁腺激素原发性甲状旁腺功能亢进症是因甲状旁腺本身(IPT):161pmol/L,诊断为“甲状旁腺功能亢进症”收病变(肿瘤或增生)引起的甲状旁腺激素(PTH)合成住我科。既往体键,患病来身高缩短4cm。家族中无或分泌过多,通过其对骨与肾的作用导致高钙血症和相关病史。入院查体:身高168cm,体重45kg,神清,低磷血症。主要临床表现是反复发作的肾结石、消化表情淡漠,营养差,无特殊面容。颈软,气管居中,右性溃疡、精神改变与广泛的骨吸收。本病可见于任何侧甲状腺2度肿大,质软,未触及包块,未闻及血管杂年龄,40岁以上年龄多见,起病缓慢,症状复杂多样。音。双肺呼吸音清。心率:80次/min,律齐,各瓣膜临床表现缺乏特异性。容易造成漏诊和误诊,而延误听诊区未闻及杂音。腹平软。肝、脾肋缘下未触及。病情。综上所述,我们认为门诊患者中如出现骨质疏脊柱生理弯曲存在,棘突无压痛。“O”型腿。双膝关松症、骨肿瘤、骨痛时,
应该想到此病并进一步化验血节稍肿大畸形,双上肢无畸形。神经系统无阳性体离子等,以免造成误诊和漏诊而延误病情。
[责任编辑:王福军 收稿日期:2005204216]征。辅查:①血离子钾:4.34mmol/L,钠:145mmol/L,
氯:113.8mmol/L,钙:3.15mmol/L,磷:0.4mmol/L.;
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②全段甲状腺素(IPT):161pmol/L;③X线数字成像全身骨骼摄影结论:甲状旁腺功能亢进症、成骨不全;④B超:甲状旁腺腺瘤、双肾结石;⑤CT诊断意见:右甲状腺后方软组织肿块,考虑甲状腺腺瘤。入院诊断:①甲状旁腺功能亢进症;②甲状旁腺腺瘤;处理原则:转外科手术治疗。