病理技术员培训

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概述

病理学是研究疾病的病因、发生机制、病理变化、结局和转归的一门学科。

病理学是一门基础学科，但又是联系基础医学和临床医学的桥梁。包括病理解剖学和病理生理学。

病理学常用研究方法：

1. 尸体解剖 2. 活体组织学检查 3. 脱落细胞学检查 4. 动物实验

5. 组织和细胞培养

1. 尸体解剖：

遗体→病理解剖、观察→正确诊断、查明死因 、解释临床症状和体征等临床现象及时发现和确诊新疾病，特别是传染病提供第一手科研材料

2. 活体组织学检查：

局部手术、嵌取、穿刺针吸→肉眼和镜下病理观察→良恶性肿瘤诊断和疑难病例确诊 乳腺癌：对乳房肿块诊断不清，怀疑非实质病变者可采取穿刺针吸小块组织做病理检查，方法简单诊断可靠率高，尤其对鉴别诊断有重要价值。如通过各种方法均未取得结果而仍诊断不清，直接切取活体组织检查。

前列腺癌：直肠指诊DRE ，在前列腺癌的筛选检查中必不可少且简单、经济、方便和穿刺活检以早期发现前列腺癌。前列腺癌的确诊必须通过病理活检证实, 经直肠超声引导下前列腺穿刺活检术操作简单、准确性高、安全、并发症少。

胃癌：

3. 脱落细胞学检查：肿瘤的普查和早期发现、早治疗

（1）宫颈癌：阴道脱落细胞检查为早期最有效的检查

（2）乳腺癌：乳头溢液者，可收集液体涂片送病理查找癌细胞。

（3）肺癌：反复痰中查癌细胞，获阳性结果，有确诊价值

（4）食道癌：食管拉网细胞学，初筛，承受度和敏感性较低，约束了其广泛使用

（5）膀胱癌：尿脱落细胞检查：是一种简单易行又无创伤的膀胱癌检查方法，对膀胱癌的诊断有重要价值，膀胱癌病人约85%尿脱落细胞检查可呈阳性。

•5. 动物实验:

•6. 组织和细胞培养：

第一节 标本制作的常规工作

•1. 清洁工作：

工作实验室要干净整洁，固体废弃物要存放于医用垃圾袋内，防止污染，保持水管通畅。

•2. 接受标本工作：

核对检查申请单、送检标本及标志，对于送检的微小标本必须认真核对容器内或滤纸上是否有组织及数量，容器无名字的应立即写上名字；检查标本固定液是否充足，按顺序存放。 •3. 标本登记工作：

将检查后的标本登记在登记卡，包括验收日期和病理编号，编号写在申请送检单右上角，按顺序排放，为取材做准备。

•4. 标本取材工作：

先核对再取材，取材后在按编号放置，脱水盒背面详细记录取材情况，并写上日期和签上取材人姓名。

第一节 标本制作的常规工作

•5. 取材后标本进行固定、脱水、包埋、切片、染色。

•6、染色后贴标签送诊断室观察，诊断发出后及时登记诊断结果，切片蜡块及时归档。 •7. 存放溶液试剂及染料的容器必须及时贴标签，注明名称和配制日期。

•8. 配制强酸试剂、挥发易燃试剂注意安全。

•9. 室内不用的电器、灯火须及时关闭。

•10. 染色液、脱水液如有沉渣，应过滤后备用。

第二章 组织切片程序

• 冰冻切片 石蜡切片 火棉胶切片

︳ ↓ ︳

——————————→先取 材←——————————

↓

再固 定

↓

冰 冻 ←———————— --- ----冲 水

∣ ↓

∣ 脱 水———————————

∣ ↓ ↓

∣ 透 明 乙醚酒精

∣ ↓ ↓

∣ 浸 蜡 胶液渗透

∣ ↓ ↓

∣ 石蜡包埋 火棉胶包埋

↓ ↓ ↓

冰冻切片 切 片 切 片

↓ ↓ ↓

染 色 染 色 染 色

↓ ↓ ↓

封 固 封 固 封 固

一、标本取材

•切取病变组织或拟研究的组织

•应选择病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交界处。

•切取标本的原则是求准而不是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以不超过24x24mm 2为佳，厚度以3—5mm 为度，过大过厚会影响对标本的固定，另方面也影响切片的制作。

病理科标本检查和取材制度

•1、标本的检查和取材由病理医师承担。

•2、病理医师通过肉眼仔细观察标本，判断病变的部位、大小、浸润深度及与切缘和周围组织的关系，然后挑选有代表性的部位取材，做病理切片。取材必须遵从规范要求，以保证诊断的准确性，提供准确的TNM 分期信息和其他与治疗、估计预后相关的信息。

•3、取材前应核对申请单编号与标本的编号、标本的份数是否相符，申请单与标本应有双标记和双核对，并仔细阅读申请单中的内容，初步判断病变的性质，做到对病变心中有数。 •4、标本检查和取材应按照有关的操作规范进行；应当对大体标本进行细致的观察，并有相应的文字记录。

•5、取材结束后必须核对组织块，并在取材记录单上标示；随后将记录单交病理技术人员，供切片染色后核对使用。

•6、组织块应该每块分别编号，并做到一一对应。

•7、取材后剩余的标本应妥善保存，保存至病理报告发出后2周时间。

•8、剩余的病理标本和标本容器属于医疗废弃物，应按照“医疗废物”的规定处理，不可随意丢弃。

•9、科室质量与安全管理小组定期对取材质量进行自查，及时总结和发现问题，制定措施，持续改进取材质量。

标本取材原则：

•1. 应详细描述标本的数量、大小（mm 、cm 、多量时聚堆测量) 、形状、色泽、和质地等

•2. 小量小标本，应全部取材

•3. 多量小标本，取材后剩余者应保管好备用

•4. 粘膜和皮肤应“立埋”以便观察各层结构

大标本取材：

•记录标本的手术类型

•描述和记录标本大小（三维长度、形状、色泽、表面、质地等）球形标本可测直径

•切面：沿大面切开，描述和记录其特点，如实性或囊性，各占比例，色泽、质地、出血坏死，囊壁厚度，内容物颜色等

•前列腺、甲状腺、胰腺等脏器应间隔一定距离做多个平行破面，以免漏掉微小肿瘤. •取代表性区域，并与正常组织交界处取材

•完整瘤体要带包膜，如甲状腺、乳腺

•取材块的大小2cmx1.5cmx0.3cm

•编号：数量、剩余组织记录“留”，全部取材时记录（全包）一包等，微小组织试做

•重取材要记录

活体小组织(小标本) 取材：

组织标本体积小, 在取材时应特别小心, 用伊红让标本着色, 并用插镜纸包裹, 以防丢失, 应标明粒数. 多瓶组织应将附号标清楚.

标本的来源与收集

(一)

1、临床活检

2、尸体解剖

3、实验动物

（二）

1、检查申请单的姓名，标本的件数是否与之相符合。

2、标本是否符合要求。

取材注意事项

1. 及时、尽可能新鲜

2. 迅速固定、冷藏

3. 刀要快，不要挤压组织

4. 注意研究目的

培养

定量

对比观察

临床诊断

临床病理取材注意事项

1、检查申请单的姓名是否与标本标注的姓名相符

2、检查申请单所列标本是否与实际标本吻合。

3、检查申请单所列标本件数是否与实际标本件数吻合。

二 组织固定

概念：用化学试剂保持尸体、器官、组织和细胞固有形态

结构的过程谓固定

所用的化学试剂谓固定剂或固定液。

目的：防止自溶、腐败，保持良好结构

原理：使组织及细胞内蛋白凝固；

使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质

方法：浸泡

灌注：局部灌注、全身灌注

蒸汽熏蒸

固定的作用

固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性酶和内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，不但使抗原不致失活，还要使抗原不发生弥散，以免在免疫组化染色时产生过深的背景。

固定的目的

1、能防止细菌的腐蚀和抑制组织的自溶

2、能凝固或沉淀细胞内或组织液的蛋白等

3、使组织硬化，便于切块

4、对某些具有传染性的标本，能防止其扩散

5、保存组织细胞中固有的物质

6、保存好大体标本

7、可增强染色

固定时间:

常规组织病理学: 可长时间固定

细胞病理学：可长时间固定

细胞化学：不宜过长，约1小时为宜

固定后处理：

充分洗涤

固定时间越长，洗涤时间也应相应增加

固定的注意事项

①一般应在离体30分钟内固定, 越及时越好, 并将组织上的血液, 分泌物冲洗干净

②固定剂的量一般不少于组织块总体积的4倍以上，一般为10--15倍，容器勿过小。

③固定的时间应视组织的种类和大小决定, 一般小组织4-6小时, 大组织18-24小时或更长。

④有特殊要求的须用特殊的固定剂; 超微结构观察：低温固定

⑤不同组织在固定时应注意特殊的处理方法

⑤不同组织在固定时应注意特殊的处理方法

•为防止组织因固定剂作用而发生变形，对软薄组织如神经、肌腱、肠系膜等应先平摊鱼吸水纸上，在投入固定剂中，可防止蛋白质凝固而引起的扭曲变形；

•对含气体而浮于液体表面的组织如肺，可连以重物使其下沉，或在组织上覆盖脱脂棉，以防止组织表面干燥。

固定液的选择

1、尽量选择对组织收缩少，渗透快的固定液

2、选择较通用的固定液，既能做好HE 的染色，又能做免疫组化标记

3、特殊的病例选择特殊的固定液

如：

狂犬病——丙酮

磷酸酶——丙酮

糖原——无水酒精

•。

固定液的分类

Ⅰ. 醛类：甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等

Ⅱ. 氧化剂类：四氧化饿（奥酸）、高锰酸钾、重鉻酸钾等

Ⅲ. 蛋白变性类：醋酸、甲醇、乙醇等

Ⅳ. 其它：氯化汞，苦味酸等。

固定液

甲醛溶液：福尔马林，Formeldehyde

4％甲醛，或 10％福尔马林

40％甲醛

用于无特要求的组织常规固定

乙醇（Ethyl Alcohol）: 95%

用于细胞涂片常规固定，糖原固定

乙醇乙醚混合固定液: 95% ：

95%乙醇+ 95%乙醚（1:1）

用于细胞涂片巴氏染色

固定液的使用

（一）甲醛（formaldehyde ）

一般市售的含37-40%，平时使用都把它看为100%。它由甲醛气体饱和于水而成。比重为

1.12，有一股刺鼻的气味。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合。如近来的抗原修复就是认为组织中的蛋白与醛产生交联蛋白后，要将它们显示出来，就必须应用温度高达92℃以上的抗原修复液，才能将其交联的醛键打开，与后来的抗体结合，将其表达出来。

甲醛的优点：

1、收缩较小

2、固定较为均匀，穿透力强

3、能使组织硬化并富有弹性

4、能保存脂肪及脂类物质

5、成本较低

甲醛的缺点：

1、成分不纯，含少量的甲醇，影响酶反应

2、含少量的甲酸，易产生色素

3、不能固定尿酸和糖类物质

4、易挥发、污染环境

5、易产生醛基、封闭抗原

应用甲醛配成的固定液有：

1、缓冲福尔马林固定液（neutral buffered formaaldehyde）

NaH 2PO 4·H 2O 4g

Na 2HPO 4（无水） 65g

蒸馏水 900ml

甲醛 100ml

2、10%福尔马林固定液

甲醛 10ml

自来水 90ml

3、10%福尔马林盐固定液

甲醛 10ml

自来水 90ml

NaCl 0.9g

4、Bouin 氏固定液

苦味酸饱和水溶液 75ml

甲醛 25ml

冰醋酸 5ml

5、Zonker 氏液

氯化汞 5g

重铬酸钾 2.5g

硫酸钠 1g

水 100ml

注：该固定液固定时间为16-24h ，染色前应用碘酒除去汞盐的沉淀，否则会影响染色后切片的观察。

（二）酒精（alcohol ）

有无水酒精（99.8%）和工业酒精（95%）在病理技术方面，酒精是一种重要的试剂，它可配成不同的浓度来进行脱水，如：60%、70%、80%、90%、95%等，在切片染色前，用酒精来除去二甲苯，在染完色后则用其来脱水。

应当注意的是，组织脱水时应根据组织的大小、器官或部位、取材的大小来确定脱水时间，一般认为浓度越低，脱水时间可以相对延长，如70%可用来长期保存标本，但如果在100%的酒精里时间就不能太长，否则组织易脆不利于切片。酒精可以与其它试剂混合，配成混合固定液，如AAF 固定液。

酒精的优点：

1、可以保存糖原和尿酸结晶。

2、能在任何比例的情况下与水混合。

3、能溶解苯类物质，为染色法中的桥梁试剂。

4、能脱去切片上的水份。

5、可配成混合固定液。

6 、可作为保存标本的固定液。

7 、可用来消毒。

洒精的缺点：

1、可溶解脂类及脂肪物质。

2、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。

3、渗透力不强。

4、可脱去某些已着染切片的颜色。

5、不作为单独的固定液。

6、价格昂贵。

三、石蜡包埋制样

组织块脱水：

逐级乙醇脱水

透明：二甲苯

浸蜡：65°C

包埋：溶解蜡

（一）脱水

• 脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂石蜡的渗入，这一过程称为脱水。

•脱水剂：乙醇

•一般情况下, 应将大小标本分别脱水. 标本脱水从低浓度开始, 一般人标本从70%或75%乙醇, 动物标本从50%乙醇开始。脱水后组织收缩、变脆。

人工脱水程序

(适应于3mm 厚的组织块)

1、30%酒精 24h 2、50%酒精 24h 3、70%酒精 24h

4、80%酒精 24h 5、90%酒精 12h 6、95%酒精 4h 7、95%酒精 4h

细小组织脱水程序

（适合于胃、肠镜活检，肝、肺、肾穿刺活检的组织）

1、80%酒精10-15min

2、90%酒精10-15min

3、95%酒精10-15min

4、100%酒精10-15min

5、二甲苯5-10min

6、石蜡15-20min

1、人工脱水法优点：

（1）可根椐不同的组织选择最佳时间。

（2）可避免细小的组织经受不必要的脱水时间, 防止组织的硬脆．

（３）可灵活掌握，随时进行观察和调整．

2、人工脱水法的不是之处：

（1）需耗人力；

（2）必须在白天完成，晚上无法进行换液；

（3）如机器发生故障，组织块被搁置在外边，致使组织干涸，影响了制片的质量。

Shandan 全封闭电脑控制全自动组织脱水机

该机由电脑、反应缸和试剂储存缸三部分构成。

电脑屏幕可显示时间、温度、所需时间、是否用真空负压等，可根据不同的时间要求，编制9套不同的组织脱水程序。

1、正常室温脱水程序

A 、10%福尔马林 2h

B 、90%酒精 1.5h

C 、95%酒精 1.5h

D 、95%酒精 1h

E 、95%酒精 1h

F 、100%酒精 1h

2、加温脱水程序

应用正常室温的脱水时间，再编入加温程序，加温的温度一般在37-40℃

3、真空负压脱水程序

应用正常室温的脱水时间，再编入真空负压脱水程序

4、周末程序

A 、10%福尔马林10h

B 、90%酒精10h

C 、95%酒精10h

D 、95%酒精10h

E 、95%酒精10h

F 、100%酒精2h

G 、100%酒精2h

H 、100%酒精2h

I 、二甲苯1h

J 、二甲苯1h

K 、石蜡65℃真空负压1h

L 、石蜡65℃真空负压1h

该机的特点：

1、容量大，一次可处理250-300个包埋盒。

2、全部密闭，试剂不易挥发，保护了环境。

3、带有定期的搅动装置，使组织固定均匀，脱水彻底，浸蜡充分。

4、脱水过程可使用真空负压和加热。

5、该机占地量小。

脱水方法及注意事项:

1. 常用试剂为乙醇。

2. 快速石蜡切片常用丙酮为脱水剂，尸体解剖标本一般在无水乙醇后加丙酮。

3. 因为脱水剂的新旧影响脱水时间, 必须灵活掌握, 根据本实验室情况, 定时更换脱水剂.

• 可用作固定液, 也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强、速度快, 可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下, 多用在无水酒精的补充脱水。

• 丙酮脱水性比酒精强, 但容易使组织过度硬化, 所以应适当掌握脱水时间。

（二）脱钙

•骨和其他钙化组织制片时应先脱钙再切片。将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。

•常用脱钙剂是5%---10%硝酸溶液。硝酸 5－10ml 和蒸馏水 加至 100ml。作用迅速，对组织不膨胀，但每日需要更换新鲜溶液，最好早晚各一次，一般1－3天完成。

•脱钙时间视组织大小和含钙多少而定，以大头针可轻松刺入为准。

1．取材：骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯

取厚度约0.5厘米骨片。

2．固定：再以10%福尔马林固定2天。

3．将组织置于脱钙剂5%---10%硝酸溶液中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。

4．流水冲洗24小时（除酸）。

5．进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。

（三） 透明

•透明的目的:

因为大多数脱水剂不能和石蜡相混合, 组织内的水份脱干净后, 必须通过透明剂的作用, 才能便于浸蜡包埋.

↓

↓

既能溶于乙醇又能溶于石蜡

↓

因在此过程中，组织中的乙醇被透明剂取代，使其折光率接近组织蛋白的折光率，组织呈不同程度的透明状光线可以透过，故称透明。

常用透明剂种类及注意事项:

1. 二甲苯是最为常用的一种透明剂，还有很多种，如三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯酚，松节油等。

2. 透明要注意的关键是时间：

透明时间不够，石蜡不能完全进入组织，影响到包埋切片 ；但是如果透明过度，组织发硬发脆影响切片质，

故组织在二甲苯中不能久留. 特别是肝脾等组织.

3. 制片过程有两次透明：

第一次组织脱水后透明；

第二次切片染色透明。

（四）浸蜡

1. 组织经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程，称浸蜡。

2. 组织经过透明后要浸入石蜡内, 目的是去除组织中的透明剂(二甲苯) 而代之以石蜡, 并渗入组织内部, 把软组织变为有适当的硬度的蜡块以便切片.

3. 一般浸蜡须经过2到3次, 石蜡的溶点为54-60度左右, 目前常用的脱水机上是两个蜡缸. 浸蜡时要注意掌握好石蜡的温度和浸蜡的时间

浸蜡作用

1、可起到填充、支撑的作用。

组织经酒精、二甲苯的作用后，其中有许多物质被溶解去，如脂肪及脂类物质、糖原等。因而遗留下许多腔隙，妨碍了切片。在切片时由于诱导剂的作用下石蜡可以浸入到物质的各个角落，当石蜡冷却时，浸入到各处的石蜡就填充在各处的空隙，包括血管和器官等。使组织保持原有的形状，也使包埋后蜡块保持平整，便于切片。

2、使切片能完整的切除并保持切片的美观

浸蜡的方法

①传统浸蜡法

将透明好的组织放入熔化的石蜡中浸渍一定的时间。

②真空负压浸蜡法

将透明好的组织放入浸蜡缸中，然后移入真空负压箱内，或者脱水机自身配有的真空负压装置进行浸蜡。

浸蜡时间，真空负压数见表。

注意

• 为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低（54度以下）的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高（60-62度）的石蜡作为第二步，第三步。浸蜡时间1－4小时，或更长，并使之过夜则较易切割 。但过长会使组织脆硬，切片时易破碎，过短，浸蜡不够，难以制成高质量切片。

（五） 包埋

•包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。 •包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。

包埋时的注意事项：

1、所使用的镊子，包埋框，最好放于37的恒温箱内，以免这些物质过冷（在冬天时）而过早冷却包埋的石蜡，影响包埋的质量，这种现象在没有石蜡包埋机的单位较为明显。

2、打开脱水盒，取出组织块，将一平整的大的一面朝下，并用镊子压平，使其保持在一水平面上。

3、每包埋完一块，应附上标签，以免出差错或张冠李戴。如为塑料包埋盒，则可少去这一步，极为方便。

4、对于管腔的组织如血管、肠、气管等应竖起来包埋对于皮肤及胃、肠、等组织应辩认好方向。仔细包埋。

5、细小多块的组织，可包埋在一个蜡块，但应保持在同一平面上，以免影响切片。

6、包埋完后，蜡面凝固，便可放入水中加速硬化，如带有冷冻设备的包埋机，则可少去这一步。

7、包埋时组织块不能使其冷却凝固，应保持组织块上的蜡处于熔化状态，这样包埋时才能和包埋蜡溶为一体。如果组织块自身的蜡先凝固，包埋后的蜡块切片时组织与边蜡分离切不成佳片严重的会崩掉，影响切片。

修切蜡块

应用包埋框包埋的组织块，切片前一定要将其切好，组织块与边蜡应保持有0.5cm 的厚度，才有利于切片。

1、有利于切片，使切片能连续切出。

2、减少损伤刀口延长刀口的寿命，以利多切蜡块。

3、有利于切片的裱贴。例如一张载片要裱两块组织时，修切好的蜡块，就能使它们摆得整齐。

•1. 组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小时

后再换以新鲜福尔马林固定数小时。

2. 组织流水冲洗6－12小时。

3. 70％酒精2－4小时。

4. 85％酒精2－4小时。

5. 95％酒精（Ⅰ）2－4小时。

6. 95％酒精（Ⅱ）2－4小时。

7. 100％酒精（Ⅰ）2－4小时。

8. 100％酒精（Ⅱ）2小时。

9. 二甲苯（Ⅰ）0.5－1小时。

10. 二甲苯（Ⅱ）0.5小时。

11. 浸蜡（Ⅰ）2小时。

12. 浸蜡（Ⅱ）2小时。

13. 组织包埋。

• 快速切片诊断是在数十分中或半小时左右制成切片并作出诊断的一种手段，主要用于手术中决定手术的切除范围和手术方式。快速切片的方法包括冰冻切片和快速石蜡切片。

•制作快速石蜡切片时，切取组织应该薄小，从固定、脱水到浸蜡的全过程都要加温，一般是先将各种试剂在超声波快速石蜡脱水仪中预热，恒温下操作，整个过程大约在10－15分钟即可完成

•快速石蜡包埋法操作过程

（1） 先取病变组织于AAF 中固定3－5分钟。

（2） 95％酒精1分钟。

（3） 无水酒精1分钟

（4） 正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分钟

（5） 二甲苯1分钟

（6） 浸蜡1－2分钟

（7） 包埋

（六） 组织切片

切片机类型：

旋转式切片机 滑动式切片机

（六） 组织切片

•石蜡切片的步骤：

1. 切片前先把切片刀磨锋利，将修好蜡块置冰箱冷冻后放在切片机上

2. 将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口成5-10度夹角。

3. 再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。

4. 根据需要调整切片厚度，一般3--5µm 为宜。

切片的步骤：

5、摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。

6、实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作。

7、切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于水箱内展平，水温45--55℃为宜。

石蜡切片的步骤：

•8、切片附贴前，可先涂蛋白甘油，防止切片在染色时脱片；附贴后放温箱内（65℃左右）烘烤10--30min ，也可置于微波炉内温火一分钟后切片上石蜡完全融化，然后染色。

冰冻切片法：

•常用低温冷冻切片机

•快速将新鲜组织固定在冷冻切片机中，冷冻数分钟即可切片，数分钟即可完成，稍后进行快速染色。

•常用于手术中快速诊断或组织化学染色和保存脂肪做特殊染色

组织切片

注意事项:

1、持蜡器一定要将蜡块挟紧挟牢，以免使其跳动而影响切片。

2、刀一定要保持无口、锋利，一次性刀片做到这一点较容易，大刀片要做到上述要求就比较困难。因此就要认真地磨好刀才能保证切片的质量。

3、裱片的水温不能过高或偏低，高者可溶化所切出的切片，低者则展不开切片，使切片留有皱纹，最适的水温应是比石蜡的溶点低2-5℃，如石蜡的溶点为60-62℃，裱片的水温则可达55-57℃，余者类推。

4、对于细小的组织，应特别小心修切，防止一刀切下，全部皆休的情况。

5、对于多块细小的组织，原则上是每一细小的组织都应有一个切面。修切的时候更应特别小心。

6、每切完一块，裱于载片后应随时刻上编号，以防止差错或混乱的现象发生，减少差错的苗头。

7、挑切片的毛笔，应选用细小柔软的毛笔为佳，用时向上挑，决不能往下，以免刀口伤及毛笔。

石蜡切片常可出现的问题

1、石蜡切片不能形成带状的原因是室温低，蜡块周边不整齐。

2、石蜡切片，切片卷起的原因是刀的倾斜角度过大或刀不快。

3、石蜡切片出现的皱折的原因是石蜡溶点低，纯度不足。

4、石蜡切片出现厚薄不均匀的主要原因是组织块挟不牢固或组织坚硬如肌瘤等。

5、石蜡切片出现波浪状的原因是组织块太硬或骨组织末完全脱钙。

6、石蜡切片，当切片放入水中裱片时，切片周围的蜡迅即向四边散开，其主要原因是组织脱水不彻底，浸蜡浸不进去。包埋蜡中含有二甲苯。

7、石蜡切片，当切片切出后蜡块向上时，把已切出的切片带走并损坏的原因是切片刀背面留有残余石蜡。

8、组织切片常见的人为性色素沉着物是福尔马林色素，常见的器官是肝、脾。

9、组织切片常见的外源性色素是碳末，常见的器官是肺。

10、石蜡切片时切片刀的最宜角度是

5℃-30℃

11、一般所称呼的标准室温是20℃

12、组织浸蜡的温度最好为

13、石蜡溶点的最高度高2-3℃即65℃。

冰冻切片

一、种类：

1、低温恒冷箱切片法

2、二氧化碳冰冻切片法

3、甲醇循环制冷冰冻切片法

4、半导体冰冻切片法

5、氯乙烷冰冻切片法

二、冰冻切片的目的

1、在手术进行中。突然发现病人的病变与原诊断不相符合或者怀疑时需要病理给予确定。

2、了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞或者转移的程度，以利于确定以后的治疗措施。

3、对于已确定恶性肿瘤的病人则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤细胞。

4、在剖腹探查所发现的肿块。

5、显示组织中的脂肪类物质。

6、某些酶的显示如ATP 酶琥珀酸脱氢酶等。

7、神经病理学中的某些染色法。

8、对某些物质所进行的免疫荧光的研究。

三、冰冻切片的操作

（1）本室现有Shandon-AS620E 型冷冻切片机的主要性能。左边的切片台可达到-60左右，冷冻箱内在0～-30间可任意调节，箱面上有电子控制板，装有急速冷冻，即放上标本启动该键机器马上进行冷冻工作并持续10分钟；有冷冻台温度显示冷冻箱内温度显示；有即时除霜内温度显示；

有即时除霜键，启动该键机器可持续工作15分钟，将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉；有照明键，启动该键可照明工作间；有消毒键当进行一星期的工作后，启动该键可对工作间进行消毒；有工作间面的密锁键启动键可将工作间锁住，除此之外该机的左边有四个按键两个为快速自动进退、两个为微小进退、另有一个手动旋钮，调节修块时的进退。

（2）切片取末经固定的组织不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整。最好24×24 × 4mm 。

（3）取出组织支承器，放平摆好组织周边滴上包埋剂，速放入冷冻台上冰冻，小组织应先取一组织支承器滴上包埋剂让其冻成一个小台再放上细小组织，滴上包埋剂。

（4）将冷冻好的组织块夹紧于切片机上修平切面。

（5）调好厚度，根椐不同的组织而定，一般在5-10um.

（6）调好防卷板，制作冰冻切片的调节，关建在于防卷板的调节，这就要求要细心，准确，将其调校，调校至适当的位置，此时切片。冰冻切片在第一时间顺利地在刀与防卷板之间通过，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载片，将其附贴上即可。

（7）用于附贴切片的载片，不能存放入冷冻的地方，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的温差，当温度较高的载片附贴上温度低的切片时，由于两种物质温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子间的彼此转移而产生了一种吸附力。使切片与载片牢固地附贴在一起。如果用冷藏的载片附贴切片，就没有这种现象发生。

（8）应视不同的组织选择不同冰冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根椐不同的组织而定，不能一概而论，例如：切未经固定的脑组织，肝脏组织和淋巴结组织等，冷冻箱的温度可调在-10℃～-15℃左右。切甲状腺，脾、肾、肌肉等组织, 则应调在-15℃ ～ -20℃左右。切带有脂肪的组织如乳腺组织，应调在-25℃左右，如为大量的脂肪组织时，应调至-30℃。

四、冰冻切片时的注意事项

1、防卷板和切片及持刀架上的地方应保持干净经常用毛笔挑除切片残余及用柔软的纸张擦。因为包埋剂常常贴在上述的地方。如果不把它们去除掉，就会影响切片。使切片不能完整切出。

2、应用于冰冻切片的组织不能过大过厚，过大难以切出好片过厚冰冻费时，最好的取材应在24 × 24 × 2cm 。

3、冰冻组织前组织放于组织支承器上应视组织的走势来给予放置，然后四周加上包埋剂，保持周边的整齐，如出现凹凸不平的地方，可用刀子将其修平，才不致于影响切片。

4、组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液在未能达到固定前更不能使用。临床快速冰冻切片不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织反而增加了切片的难度。如果使用了未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶，这是因为含水溶液的固定液在组织未经固定前，其中的水份也会渗入到组织当中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中形成了冰晶。

5、当切片时，如果发现组织冰冻过度时，可将冰冻的组织取出来，于室温中停留片刻，以利于软化组织，使其不致于过度冰冻。

五、冰冻切片的快速染色

1、用普通染色进行染色（HE 染色）

（1）固定、切片用电吹风吹干后于10%的福尔马林盐或纯丙酮中固定2分钟后自来水冲洗。

（2）滴少许苏木素染液于切片上于酒精灯上加热染色，当见有蒸汽时即可中止染色，快速水洗、分化、用热水促其蓝化、伊红对比染色、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

2、超声波快速染色法

（1）固定：切片的固定与上同。

（2）把水洗后的切片插入装有苏木素的玻璃瓶中超声波处理30sec 或1min, 水洗、分化、放于

装有热水的玻璃瓶中、超声波处理30sec, 酒精脱水，二甲苯透明封固。

结果：经上述各种方法处理后所制作的切片。细胞核呈蓝色，软骨基质钙盐深蓝色，胞浆呈深度不同的粉红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，胶原纤维量粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色，切片完整，未见有冰晶出现。

第六章 切片染色与封固

一、染色：

利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。

一、染色

•目的:

将组织切片浸入染色剂内, 使组织或细胞等成分染上不同的颜色 产生不同的折射 , 以便在光学显微镜下观察.

•方法:

苏木素- 伊红染色称常规染色, 又称HE 染色.

其他染色方法称特殊染色(特染).

染色原理

•1、化学反应：

利用组织细胞内酸碱性的不同，其与阴阳离子结合力的不同，染色也不同。 如：细胞核呈酸性＋碱性染料(氧化苏木素) →深蓝色

细胞浆呈碱性﹢酸性染料(伊红染料) →不同深浅的红色

2、物理作用：

①毛细管作用及渗透作用

②吸收和溶液作用：如复红溶液为红色，所染

组织也为红色，但干燥复红为绿色

③吸附作用

染色术语

•⒈媒染剂：与染料或组织发生结合作用，促进染色能力的物质，如铁明矾、钾明矾等。

•⒉促染剂：能使组织易于着色的物质，它与媒染剂不同，不直接参与染色反应，如醋酸、碳酸等。

•⒊分化剂：如酸碱类分化剂，又称退色剂；氧化退色剂，主要用于漂白作用。

染色步骤:

脱蜡

（1）二甲苯I 5分钟

（2）二甲苯II （应完全透明） 5分钟

逐级降浓度酒精水化脱二甲苯

（3）无水酒精I （变为不透明） 1－2分钟

（4）无水酒精II 1－2分钟

（5）95% 酒精 1－2分钟

（6）80% 酒精 1－2分钟

（7）自来水洗 片刻

染色步骤

（8） 蒸馏水 片刻

（9） 苏木素液染核 10—15分钟

（10）自来水冲洗 片刻

（11）1%盐酸酒精分化 0.5—1分钟

（12）流水冲洗 片刻

（13）碳酸锂饱和水溶液反蓝 1分钟

（14）流水冲洗 5--10分钟

（15）复染 0．5％伊红水溶液（对比染色）

2—5分钟

染色步骤:

•逐级升浓度酒精脱水（若为醇溶伊红可直接人90％酒精）

（16）自来水洗（分化伊红） 片刻

（17）95％酒精I 1－2分钟

（18）95%酒精 II I—2分钟

（I9）无水酒精 I 1—2分钟

（20）无水酒精II l－2分钟

•透明

（21）二甲苯I 5—10分钟

（22）二甲苯II 5—10分钟

（23）盖玻片下封固

•染色结果: 细胞核：蓝色，软骨基质钙盐等深蓝色；细胞浆深浅不同的粉红色，嗜酸性颗粒鲜红色；胶原纤维呈粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色，红血球为桔红色，蛋白基质为粉红色。

• HE （Hematoxin Eosin,HE〕染色

•1〕苏木素染色配方：

• 苏木素 1g

• 纯酒精 10ml

• 钾明矾 20g

• 蒸馏水 200ml

• 氯化汞 0.5g

•2〕伊红染色配方：

• 伊红 0.5-1g

• 蒸馏水 99ml

伊红染液

•

配方：伊红Y （水溶） 0.5—lg

蒸馏水 99ml

若取用伊红Y （醇溶性）应溶于99ml75％或95％的乙醇中。若在伊红液中加人0.5毫升冰醋酸，可加速其染色过程，并使胞浆的色泽更为艳丽

HE 染色过程中的要点：

•切片脱蜡务必干净彻底

•脱苯和酒精要彻底

•苏木素染色液配制及盐酸酒精分化较为重要

•各级水洗应充分及伊红染色要适当

•切片固封树胶要适当

染色时的注意事项

（1）切片烘烤以切片附贴牢固为原则，否则容易掉片。

（2）切片脱蜡一定要彻底，不然会导致染色深浅不一。

（3）切片染苏木素前可令其无水化，这样可延长苏木素的寿命。因为每次染色前，切片水洗，然后进入染液虽然每次带入的水分很少，但随着次数的增加，所带入的水分足可以稀释染液影响染色的质量。

（4）切片在苏木素的染色时间应充分宁过勿不足。对于初学者来说更应过染，否则分化会过度导致染色过浅。

（5）切片分化时，要根椐不同的组织来确定分化时间，并不断积累经验。

（6）伊红染色时间也要充分，经低浓度洒精时应仔细观察，必要时快速通过，以免过于褪色。

（7）切片致无水酒精后，不要在控干无水酒精时让切片干涸，可以不经控干直接地进入碳酸二甲苯（也可以进入二甲苯酒精混合1：1）碳酸有较强的吸水性透明也好很适合南方地区。

（8）切片从二甲苯中取出封固时，切不能让其干涸，因南方地区空气潮湿干涸的切片与空气接触，可吸收其水份。这样的切片很容易裉色。切片不干涸，表面被着二甲苯，由于它不溶于水起到与水隔绝的作用。

（9）滴中性树胶封盖切片，胶不能太浓，太浓胶难以均匀铺开，且易产生气泡，又不能太稀过稀的胶由于二甲苯含量较多，当切片干燥时，二甲苯挥发掉，胶封的切片收缩，即可导致一半切片没有被胶封固的结果。最合适的胶应是滴下成珠。

（10）封固切片时，盛胶的瓶子及瓶盖四周不要留有余胶，否则瓶盖难以打开。因此每次用完后都必须将其擦干净。当打不开瓶盖时应放入烤箱中烘烤，即可打开。

（11）标签附贴要认真，不要贴得歪歪斜斜，影响切片的外观.

1、切片机的使用，应如何注意保养？

切片机座应注意平稳，切片时应注意摇转速度的快慢要尽量保持均匀一致。滑动面要经常滴上机油，以利于滑动及旋转自如和防锈，切片完后除去残蜡，取下切片刀，先用湿布擦去余蜡，继用干布擦干，再用油布擦一遍，最后用罩盖好切片机，以防灰尘落于机上，影响机器的运转。

2、化学试剂使用时的注意事项

（1）已打开的药品或染色时的玻璃瓶染色液，每次用后即随手盖紧，以免挥发，易挥发易吸

潮的药品用后蜡封。

（2）易燃的试剂要远离火种，谨防火灾，因病理科有较多的易燃化学试剂。

（3）强酸，强碱试剂或有腐蚀性的废染液，不要直接倒入下水道，以免腐蚀下水道，造成不必要的损失。

（4）易变质或易氧化失效的试剂，应标明配制日期，妥为保存，有的只能一次性用完，因此, 应本着节约的原则，用多少，配多少，切勿造成浪费。

3、石蜡切片刀应怎样保养好？

切片刀要经常磨，保持锋利无刀口，每次用完后用布擦干净，再用油布擦，以防刀口生锈影响切片。

4、如何使树胶处于中性状态？

取少量无水碳酸钠，加入到封固用的树胶中搅拌后放置数日取其上清液，即为中性树胶。

5、切片染完苏木素后的分化，应该如何控制和注意什么问题？

（1）分化液中盐酸不能高于1%，否则会因分化过强而将已着色的颜色大部分脱水，造成染色过浅。

（2）对各种组织应视情况而定，如淋巴结的切片，应分化较长时间等。

（3）分化完后，应在显微镜下观察，如发现核中的物质不清楚，则应继续分化至清晰为止。

（4）要认真操作，细心观察，不断总结。

6、切片欠佳表现在哪些方面？

切片欠佳的主要表现有：切片见有刀痕皱折、横裂、折叠、不全、破碎、组织松散。厚薄不匀或呈波浪状等现象。

二 封固

• 盖玻片下封固

结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其它成分呈深浅不同红色

• 国产中性树胶 封片, 注意树胶量适中, 掌握封片手法, 防止气泡.

二 封固

注意事项：

•1. 配制封固胶时浓淡要适宜，以恰能滴下成珠为宜，用前搅拌均匀。

•2. 使用时要适量。

•3. 封固切片时，切片上剩余二甲苯不要过多也不要过干，如遇少量气泡可用镊子轻压盖片，切勿放烤箱内，如气泡不易压出需将切片置二甲苯后重新封固。

第七章 特殊染色

HE 染色虽是一种快速、经济、且易掌握的方法，但它不能回答病因学、Z 组织发生及发病机制等方面的许多问题。而特殊染色可以协助解决病理诊断问题。

特殊染色法是为了达到某些特殊的要求，或是为了观察特殊的组织结构。

一、脂肪染色

主要用于心、肝、肾的脂肪变性，动脉粥样硬化，以及因脂肪栓塞导致的死亡病例

鉴定等。

试剂配制：苏丹染液

苏丹III 或苏丹IV0.5g ，70%乙醇250ml ，丙酮250ml

染色方法：

1. 标本常规甲醛固定后流水冲洗12h ；

2. 用滤纸吸干标本表面的水分，把标本放入苏丹III 染液中浸泡30min ；

3. 用70％乙醇分化，以脂肪组织呈橙黄色，其它组织不着色为佳；

4. 水洗后浸存在5％甲醛液中，为了防腐可加入适量的防腐剂。

二 弹力纤维染色法

• 病理诊断应用弹力纤维染色，目的是观察组织内弹力纤维是否增生或破坏、断裂和崩解，从而帮助诊断。

•试剂配制：

• 地衣红酒精液 1g

• 70%酒精 100ml

• 浓盐酸 1ml

•结果：Taner-Unna 法，弹力纤维呈深棕红色。

• Verhoeff 铁苏木素染色法，弹力纤维呈黑色。

Verhoeff 铁苏木素染色法

三、六胺银（PASM 〕染色

• 在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织选用此方法

PASM 染液的配方：

• 2％硝酸银水溶液3ml ；

• 3％六次甲基四胺液25ml ；

• 5％硼砂2ml 。

•注：2％硝酸银配制胺溶液，染色时间40分钟，温度

• 55~60℃，随时镜下观察便于控制。

PASM 染色法：

•（1〕1％过碘酸水溶液内染10分钟；

•（2〕自来水冲洗，蒸馏水冲洗；

•（3〕入5％铬酸水溶液40分钟，出此溶液后用1％亚硫酸钠除掉铬酸；

•（4〕自来水洗数次，蒸馏水洗3－4次；

•（5〕入六胺银染液（50－60℃〕40分钟，20分钟后，每5分钟镜下观察一次，蒸馏水洗四次； •（6〕入0.2%氯化金水溶液1－2分钟，蒸馏水洗三次；

•（7〕入5％硫代硫酸钠水溶液1－2分钟，蒸馏水洗数次；

•（8〕复染HE ，脱水、透明、封片

•结果：底膜呈黑色，网状纤维呈黑色，细胞核呈蓝色，背景呈粉红色

四、淀粉样物质染色（介绍刚果红染色）

•. 淀粉样物质是一种嗜伊红性物质，性质属于糖蛋白成分。组织出现此物质称为淀粉样变性。

•1〕试剂配制：

•（1〕刚果红染色液。刚果红1g ，蒸馏水100ml ；

•（2〕Harris 苏木素染色液。

淀粉样物质染色（介绍刚果红染色）

•2〕染色步骤：

•（1〕苏木素染色液浸染2分钟；

•（2〕0.5%盐酸乙醇分化数秒钟；

•（3〕流水洗，蒸馏水洗2次；

•（4〕刚果红染色液中25分钟；

•（5〕无水乙醇迅速脱水2次；

•（6〕二甲苯透明，中性树胶封固。

•结果：淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。

第八章 细胞学检查技术

•细胞学检查是肿瘤病理诊断和普查较常用方法。

•特点：简便、快速、无创伤，可反复多次检查。

•对于肿瘤，只做初步诊断，确诊依据活体组织学检查。

常规细胞病理学技术

一、取材、涂片制备

痰涂片、胸水、腹水及尿液制片

二、固定

三、染色 (巴氏染色)

常用固定液

（1）等量95%乙醇和乙醚混合液

（2）氯仿酒精固定液

（3）95%酒精固定液

（4）福尔马林固定液

细胞学研究，固定液选择要根据实验要求条件而定，如用细胞涂片作原位PCR ，固定液要选用多聚甲醛。

巴氏染色步骤

1．标本95％酒精固定3-5分钟

2．Harris 苏木素液5-10分钟

3．水（蒸馏水或自来水）漂洗2-3次

4．1％盐酸水溶液（或1％盐酸酒精液）

浸1-3次

5．自来水浸洗1-2次

6．自来水或稀碳酸锂（100ml 蒸馏水中加碳酸锂饱

和液1滴），涂片返蓝为止

7．依次置入70％→80％→95％酒精，

各2分钟

8．桔黄G6液，1分钟

9．95％酒精Ⅰ、Ⅱ缸，各1分钟

10．EA36液，5分钟

11．95％酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 各1分钟

12．无水酒精Ⅰ、Ⅱ，各1分钟

13．二甲苯Ⅰ、Ⅱ，各2分钟

14．中性树胶盖片封固

涂片制备

•注意要点：

1. 涂片动作要轻柔；

2. 涂片要均匀，不易太厚或太薄；

3. 涂片时要避免来回摩擦损坏细胞。

•适宜的涂片是涂片的细胞占玻片的2/3，在镜下每个视野内都布满细胞，间隙很小。 涂片固定

•1. 湿固定法:

即趁标本新鲜而湿润时即投入固定液内，这种标本染色后，染色鲜艳，结构清楚。 常用于痰液涂片、阴道涂片、宫颈涂片、穿刺涂片、食管拉网术涂片等。 •2. 干燥固定法：

即等待涂片自然或吹风机吹干后在固定。

•固定液：95%酒精

•固定时间：10--20分钟

•染色方法：常规HE 染色

第九章 大体标本制作有关知识

•1. 大体标本的收集

通过尸体解剖和活体组织（包括外科手术切除标本和活体组织穿刺标本〕检查时发现并收集。

•2. 大体标本的取材：

越新鲜越好

3. 大体标本的固定

•1〕固定的目的：

将受检组织尽快地侵入固定液内，使组织和细胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐败，使其保持与生活状态有相似的结构，以利于切片和观察。

•2〕固定液的选择：

A. 甲醛（Fomaldehyde 〕，又称福尔马林，其浓度在4％，它是一种还原剂，极易挥发，散发出强烈的刺激性气体，使人流鼻涕、流眼泪，呼吸道有异物感。

B.95％酒精（乙醇〕，除具有固定组织的作用外，尚有脱水作用

3. 大体标本的固定

•固定要求：

1. 固定后达到防腐的目的；

2. 能长期保存组织原有的体积和特色；

3. 标本自然颜色长期保存后再做组织切片也不影响染色效果

•一般用10%甲醛溶液固定，不易用有色的混合固定液。

2. 动物标本取材:

①动物致死法

麻醉法, 空气栓塞法, 断头法, 击头法, 股动脉放血法等, 要求动作迅速, 及时解剖, 取材与固定 ②动物取材注意事项:

准备好锋利的刀剪, 固定液, 取材应新鲜, 最好是心脏还在跳动时取材, 并立即投入固定液. 组织块厚度不超过3mm(应将组织上的血液, 渗物, 粘液粪便等用生理盐水冲洗干净, 选好组织块的切面, 切除不需要的部分, 再固定), 应尽可能维持组织原形, 对神经肌肉皮肤组织, 可将其两端固定在木板或硬纸板上, 然后再固定.

用化学反应原理，在切片上滴加某种化学试剂，使之与组织或细胞中的生物化学物质结合，再用显色剂使之显色，达到定位、定性地显示组织或细胞中的某种物质成分，这种技术称为组织化学和细胞化学技术。其结果可用显微镜和电镜观察。结合定量病理学技术，还可对有关成分定量。

• 糖类

• 脂类

• 核酸

• 酶类

• 胶原纤维

• 弹力纤维

• 神经纤维

• 细胞膜、核膜结构

概念：免疫组织化学技术是指利用已知的抗

体与组织中相应的抗原结合，并利用

显色剂在原位将抗原物质显示出来

原理：抗原＋抗体＋显色剂

特点：在组织中原位显示某种特异性抗原

常用显色剂种类：酶、金属粒子、同位素

生物素、化学显色剂（DAB ）

结果观察：显微镜、透射电镜

抗 原 ← 组织中

+

抗 体 ← 试剂

↓

抗原抗体复合物

+

第二抗体 ← 标记有显色底物

↓

显色反应 ← 显色剂 (DAB)