小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备_郎洪彦

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LIF和FGF等生长因子，具有同化培养液，改善接种细胞生长环境和抑制细胞分化的作用，所以常用来制作饲养层。饲养层主要用于对一些特殊细胞如胚胎干细胞、精原干细胞、哺乳动物各种组织的干细胞的培养［1］。

但有时实验室研究所需要的饲养层细胞有限，不适于大量的培养、冷冻保存。这种情况下，需要找到一种更有效的方法来解决这一问题。本实验通过将酶消化培养法和组织块培养法结合来制备小鼠胎儿成纤维细胞，可在不同时间获得饲养层，以期在一定程度上满足实验室研究对少量饲养层的需求。

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物中心）。按公母鼠1∶4的比例当晚合笼，次日早7∶00检查阴道栓。见栓日记为妊娠0.5d。选妊娠13～15d的母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备。另外推算分娩日期，分娩当日记为0d，选取7～8日龄的小鼠进行精原细胞的制备。1.21.2.1

实验方法

成纤维细胞的制备

采用酶消化培养法[2

～6]和组织块培养法[10]结合进行成纤维细胞的制备。1.2.2饲养层的制备

选取已铺满皿底的小鼠胎儿成纤维细胞，吸去培养液。加入适量的含10

11.1

材料和方法实验动物

昆明系小白鼠（购于黑龙江省中医学院实验动

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´øÖеÄϸ°û£¬¾-´¿»¯ºóÒÔ104个/cm2左右的密度接饲养层细胞对于一些特殊细胞（胚胎干细胞、种到胎儿成纤维饲养层上。采用2.5%的血清浓度，精原干细胞、成体干细胞等）的培养来讲是必须的。

［7～9］

置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。因其能够分泌LIF和a-FGF、b-FGF等生长因子，

具有同化培养液，改善接种细胞生长环境和抑制细

2试验结果

胞分化的作用[2]。将精原干细胞接种到本方法制备

2.1两种制备成纤维细胞方法的对比的饲养层上，经原干细胞可长期存活，增殖并形成

通过酶消化法和组织块法都可获得成纤维细集落。这说明通过此种方法制备的小鼠胎儿成纤胞单层，用于饲养层的制备，但二者形成细胞单层维细胞饲养层，能满足体外培养的少量需要。的速度不同，酶消化法制备的成纤维细胞的原代培养形成80%汇合所需时间较短，一般2.3±0.1d左右即可形成细胞单层，且在整个培养区域形成的单层比较均匀（图1）。但不易形成梳状结构。而组织块培养法制备的成纤维细胞（图2）形成细胞单层的速度较慢，需要5.1±0.3d左右的时间才可形

图1图2成细胞单层（见表1）。且整个培养区域内形成的

单层较不均匀。但局部区域（组织块周围）易形成排列整齐的梳状结构。

因此，利用这两种成纤维细胞制备方法在铺层时间上的差异,可将一只母鼠的胎儿成纤维细胞分成两批制成饲养层，从而满足不同时间对饲养层的

图3图4

少量需求。见表2。

表1不同方法制备原代成纤维细胞的铺层时间组织块培养法45.1±0.3**

*：差异显著**：差异极显著

注：图1酶消化法制成的成纤维细胞（原代1天;150×）；图2

组织块法培养的成纤维细胞（原代5天;150×）；图3组织块和从组织块中迁出的成纤维细胞（组织块培养法150×）；图4精原干细胞接种后增殖形成的团链状结构（300×）。

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（译著）体外培养的原理与技术，科学出版社.[10]薛庆善2001.[1]

表21只母鼠的胚胎所获得的胎儿成纤维细胞瓶数组织块培养法410.2±1.3

2.2精原干细胞的体外培养

精原干细胞接种到饲养层后可进行增殖和生长，形成团、链状的结构（见图4）。3

讨论

将酶消化培养法和组织块培养法结合起来制备成纤维细胞，这样可以将两种方法的优缺点进行互补。第一，既可以避免酶消化法制备过程中的反复消化操作而易污染的缺点，又可在较短时间内获得大量细胞用于培养，从而在较短的时间内获得饲养层。第二，将酶消化法中的剩余组织块直接进行培养，可以在稍晚一些时候获得成纤维细胞单层，这样可使成纤维细胞得到充分利用。因为一只母鼠的胚胎可制备20瓶左右的成纤维细胞，而有时培养所需饲养层有限，如果都采用酶消化法可能造成成纤维细胞有多余。第三，组织块培养法少了酶消化步骤，可节约费用。第四，组织块培养法在局部形成的成纤维细胞层要好于酶消化法。

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