一氧化氮发现的故事

在寻找更为复杂的生物分子的科学家忽略了。此外，NO性质独特，其作用方式不同于经典生物活性物质或神经递质，如神经系统中NO既不储存于末梢突触囊泡中，也不以胞吐方式释放，而是靠其脂溶性在细胞内、细胞间弋，通过化学/自由基反应发挥作用并灭活。但NO的发现绝非偶然，其客观上被应用和研究的历史实际上已长达一个多世纪。

对硝基化合物的应用和认识

早在19世纪70年代，人们就发现有机硝酸酯对缺血性心脏病有良好的治疗作用，但当时并不了解其作用机理。19世纪末，在诺贝尔以研制TNT炸药闻名和发迹的同时，人们惊奇地发现，用于治疗缺血性心脏病的硝酸甘油（GTN）竟是TNT的主要活性成份，人们对此困惑不已。

直到本世纪60年代，科学家发现亚硝胺在体内具有致癌作用，继而开始研究生物体内亚硝酸盐（NO2-）的代谢。发现机体在正常情况下就可产生和排泄NO2-和硝酸盐（NO3-），其中巨噬细胞是体内NO2-来源之一。在此期间，多种硝基类扩血管药物更广泛应用于临床，并成为急性心肌缺血的首选急救药。值得一提的是，早在上世纪末，德国学者Griess就研究和发表NO2-的检测方法，但当时对其与NO的关系并不了解。由于NO2-是NO在水溶液中氧化代谢的终产物而相对稳定，改良的Griess法至今仍是目前实验室间接检测NO含量最简单、最常用的方法之一。

EDRF的发现

在药理学实验室里，另有一些科学家，对于看似与NO并无直接关联的乙酰胆碱（ACh）等血管活性物质的作用机理颇感兴趣。1953年Furchgott博士发表了首篇ACh和组胺致兔离体血管条收缩的论文。这与当时公认的给整体动物静注ACh或组胺引起血管舒张效应的观点恰恰相反。但他当时坚持自己的实验重复性良好，且观察无误。并在随后（1955年）发表的“血管平滑肌药理学”综述中提出假设，认为犹如肾上腺素能有α和两种受体一样，血管平滑肌上也同时含有运动性和抑制性两种胆碱能受体——现在看来这一结论是错误的，然而在当时这一观点一直被当作权威而认可。其间在1962年，有一个叫Jellife的医生曾发现并报道在血清素预收缩的血管环上，低浓度ACh通常是导致其舒张，仅当很高浓度ACh（＞10-4mol/L）时才使血管收缩。遗憾的是这篇文章当时并未引起人们的重视。直到70年代中后期，虽已有更多实验室发现并报道ACh对离体血管的舒张作用，但一方面由于对“权威”的崇拜，另一方面由于对此问题报告结果尚不完全一致，且当时已确，ACh对非血管平滑肌的作用是收缩效应，致使在ACh对离体动脉血管作用的问题上虽存在着明显的矛盾[后来Furchgott称此为“ACh悖论（the paradox of ACh）”]，但在长达20年时间里却一直无人深究这一问题并对Furchgott的理论提出质疑。直到1978年，还是在Furchgott的实验室，一次偶然的事件才使这一矛盾得以澄清。

其起因是该实验室一名叫David的技术员的粗心。他未按Furchgott为他写好的实验步骤操作，结果发现拟用于预收缩血管的胆碱能M受体激动剂carbachol（CCh，ACh类似物）并不使兔主动脉环收缩，相

反却总是使其舒张。他到办公室找到Furchgott抱怨说：“一定是哪儿出了问题”。Furchgott来到实验室仔细检查了实验，他首先注意到David没有按他写明的加药顺序进行实验，即在还未洗掉浴槽中去甲肾上腺素（NE）时就加入了CCh，这时血管环正处于收缩状态。同时他发现CCh确实总是引起收缩状态的血管环舒张。于是他们一起检查其原因：是CCh被NE污染了？可重新配制的CCh仍使动脉环舒张；再用新配的ACh替代CCh加入浴槽，仍是舒张反应。此时Furchgott注意到，他以往实验用的是螺旋血管条标本，而David采用的则是更易制备的主动脉环。于是他们开始比较这两种标本制备是否会造成血管反应性的差异。他们首先把对ACh呈舒张反应的血管环取出浴槽、剪成血管条，再挂入浴槽后加入ACh。此时Furchgott注意到标本制备时干净利落，一次就顺利挂入浴槽的血管条往往都对ACh呈明显舒张反应，而对ACh无舒张或舒张反应弱的那些标本多是被反复操作使内膜面受摩擦的血管条——这是他们得到的第一个线索：即无意的内膜摩擦可能导致血管失去对ACh的舒张反应。

继之他们又仔细检查了螺旋血管条的制备方法（这是Furchgott实验室25年来一直使用的常规血管标本制备法）。Furchgott此时又惊奇地发现，他们以“常规方法”制备血管条过程中，血管内膜面恰好一直搭在手指尖上，且为防止血管条卷曲，他们又通常是把剪下的血管条内膜面朝下平铺于湿润的滤纸上，再切成长短适宜的血管条。他们立即改进上述方法，小心保持不触及内膜面，结果发现，这样制备的血管条对ACh则呈良好的舒张反应。他们把这一发现立即在当年7月一次学术讨论会上作了报告，摘要发表于《血管（Blood Vessels）（1979）上。这是首篇打破“ACh悖论”、接近于发现EDRF的正式学术报告。 然而为什么动脉血管内膜面摩擦会导致其丧失对ACh的舒张反应呢？虽然内皮细胞被列入怀疑对象，但当时Furchgott首先想到的是机械摩擦造成血管壁细胞损伤，损伤的细胞释放某种酶使血管平滑肌上的M样“舒张”受体失活。为此，他们又走了一些弯路。其间一位组织学家的工作险些葬送了他们的发现：Furchgott将呈良好舒张反应和摩擦后不舒张的两种血管环标本送到另一实验室做组织学检查，经切片、固定、染色后送回来的片子上两种标本都不含内皮细胞，也就是说，这一组织学结果已排除了内皮细胞在舒张反应中的必要。庆幸的是，半年后他的实验室来了一位新技术员，他改进了组织染色方法，而终于发现内皮细胞的有无是血管舒张与否的关键。1979年春，第二篇更接近EDRF的论文摘要投寄至美国药理与实验治疗学学会年会上并在当年报告，该论文已明确提出血管内皮细胞与血管反应性有关。

接下来的问题是：为什么刺激内皮细胞可引起血管平滑肌舒张？这次似乎是单刀直入，他们首先想到的是血管内皮细胞受刺激后释放某种物质扩散至平滑肌并导致其收缩。Furchgott象是受到某种特殊的启示，他回忆道：那天早晨我刚醒来，一个漂亮的实验设计突然闯入我的脑海。于是我来到实验室，立即按这一方案进行了实验——得到的结果便是本文开始提到的1980年发表于Nature上的那篇著名论文“内皮细胞是ACh诱发动脉平滑肌舒张的必需因素”。

该文仅用了离体血管条灌流和光镜组织学检查两种非常简单的实验技术，其令人叹服之处在于血管条实

验的设计。实验分四步观察不同情况下兔主动脉对ACh的反应：

（1）正常血管及与内膜摩擦处理后的比较；

（2）正常血管环与胶原酶处理（化学损伤内皮）后相比较；

（3）a、横血管条（与管壁平滑肌走向一致）并去内皮，b、纵血管条（与平滑肌垂直）含内皮，c、a与b并列挂在同一个浴槽，内膜面相近且相对，d、c实验完后立即移除b；

（4）正常血管环，浴槽内通O2与缺O2（通入N2）的比较。其中第（3）步的精彩和第（4）步的出人意料使人印象颇深。（3）中所用方法即是后来被称之为sandwich preparation的“三明治”血管灌流模型。

（4）中所得实验结果直到数年后明确内皮细胞释放的就是NO、且NO生成需O2时，人们才由衷地叹服Furchgott当年实验的巧妙，真像“鬼使神差”！

值得一提的是，在Nature上的这篇文章当时还没有明确提出EDRF，直到1982年他们发表于《美国国家科学院通报》（PNAS）上关于BK内皮依赖性舒血管作用的论文中，才正式提出EDRF这一名词。这其间还有一个小插曲：此文投稿前他们曾一起讨论如何命名这一舒血管介质，其中

endothelium-derived relaxing三字很快被确定，只是最后一字是用substance、factor还是material未决。最后他的学生一致认为选factor为妙，因relaxing factor（舒张因子）的缩写RF恰好与老板

Robert F. Furchgott名缩写RF巧合，以此来纪念Furchgott及他领导的实验室。Furchgott欣然接受了这一荣誉。

NO是EDRF的确证

EDRF很快引起了世界上众多心血管生理及药理学家的兴趣，其作用被多个实验室重复并验证。那么该EDRF究竟为何物？Furchgott最初推测该介质应是一种较稳定的物质，可能是脂氧化酶（lipoxygenase）作用于不饱和脂肪酸的产物。然而对此物质的确定似乎比他们想象的要复杂，研究迟迟未取得明显进展。与此同时，英国Wellcome研究中心Moncada研究小组发现EDRF并不稳定，认为其可能是自由基或前列腺素家族类小分子；美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）药理系Ignarro实验室则发现EDRF与硝基类扩血管物质作用机理相似，即都是通过升高血管平滑肌细胞内cGMP途径，且两者在药理学特性上有诸多相似之处。而在Texas大学医学院，多年来一直独立从事硝酸甘油扩血管作用研究的药理学家Murad，实际上早在1977年就发现硝基酯类药物及外源性NO均可使cGMP增高，他们甚至提出硝基酯类药物可能是通过形成NO或某种活性物质升高细胞内cGMP，进而使血管扩张和血小板抑制。至此，众多研究汇聚到一个焦点——硝基类活性物质。

1986年中，Furchgott和Ignarro几乎同时分别提出NO可能与EDRF为同一种物质或其组分之一。1987年Moncada又以巧妙的实验设计得出令人信服的证据，在Nature上发表了“NO释放可解释EDRF的生物活性”论文。他们将培养的血管内皮细胞铺附于微载体（microcarrier）上，然后装柱并以Krebs液灌柱洗

脱，流出液以不同时间间隔瀑布式淋浴去内皮细胞的兔胸主动脉条以检测EFRF的生物活性，同时用化学发光法（chemiluminescence）检测流出液NO含量，并将流出液与GTN的药理作用定量对比。他们发现，由BK诱导的血管内皮释放的EDRF，不仅与NO在生物活性、半衰期等生物学特性上完全一致，亦可被同样的药物阻断剂或激动剂所抑制或增强。

至此，NO脱颖而出，一跃成为生物医学界关注的焦点，人们形容这一“不起眼”的小分子为“灰姑娘”。而在此领域的研究更是突飞猛进，科学家很快相继证实NO即为诸多硝基类扩血管药物作用的终效应分子，L-Arg是生物体内NO生成的前体，并纯化了NOS。1991年美国Johns Hopkins大学神经药理学家Bredt等进一步在脑组织中克隆出NOS，从而全面揭示了生物体内L-Arg-NOS-NO系统。

NO发现给我们的启示

其一，科研思路（idea）是科学研究的首要因素。发现EDRF的实验并未借任何“现代”仪器，使用的仅是常规血管条灌流和普通光镜组织学检查方法。而其实验设计匠心独到，尤其是“三明治”血管灌流实验让人叫绝。无独有偶，这与70年前（1920）采用离体心脏灌流实验发现“迷走递质”（ACh）而获诺贝尔奖的奥地利生理学家Loewi的实验可谓有异曲同工之妙。同样，Moncada等以培养的血管内皮细胞装柱淋浴灌流去内皮血管条的生物检测法亦相当精彩，令人难忘。这些都可谓“简单实验，优秀设计

（easyexperiments, excellent design）”的典范。这些大师的工作再次告诉我们，在研究方法的选择上不必一味追求高精的仪器，而以能使结论明确、说明问题为原则。手段单纯、设计巧妙有时可使结论更明确。关键在思路！

其二，尊重实验结果，让实验说话。Furchgott是一位典型的坚持“让实验说话”的科学家。基于实验，他曾由于对难以预料的实验条件的认识或控制不当而作出错误的结论，但也正由于他对实验的尊重，使他认识到自己的错误，最终得以发现EDRF；前文中提到的Jellife不畏权威的观点，不附和当时大多数人的结果，如实将自己的实验结果报告，而使他原本并不复杂的工作，在二十多年后的今天仍被人们反复引用；还有那个“粗心的”技术员David如实地将实验结果报告，使Furchgott有机会发现EDRF……。

其三，活跃、竞争的学术思想是独创精神不可缺少的土壤。Furchgott1980年发现EDRF，启发了药理学家对血管内皮细胞功能多样性的认识。时隔不到两年，Vanhoutte实验室又提出了内皮收缩因子（EDCF）的存在，还有人提出内皮超极化因子（EDHF）。1986年美、英的多个实验室先后证实NO即为EDRF；1988年日本学者Yanagisawa又发现了内皮素（endothelin，ET）。血管内皮研究领域一时新星争相辉映，在不到十年的时间里，在发现EDRF思路的启发下，内皮细胞的研究取得了令人震惊的进展，并出现了“内皮生物学”这一新的学科，《内皮生物学杂志》也应运而生，几十种NO工具药被研制开发，“伟哥（viagra）”等基于NO机理研制的药物迅速应用于临床。如果没有创新、活跃的学术思想和竞争的学术环境，在如此短的时间内取得这样的研究进展是难以想象的。

因此，我们不能只抱怨缺乏科研资金、缺乏实验条件，这对时至今日的科研工作固然相当重要。但更重要、实际上也是我们更缺乏的是科研思路，是创新的意识和思维。我们目前在硬件上与国外相比确有差距，但切不可因此认为我们与科学发现相距遥远。实际上，在科研中最重要的思路上，我们与国外科学家应是站在同一起跑线上。我们一定要意识到学术思想才是第一位的！有好的素质、好的思路，在我们现有实验条件下同样可能做出优秀的工作。Furchgott发现EDRF和NO的故事，不是又一次给了我们这样的启示吗？

自1980年，一氧化氮在生物学上的重要地位被提出以后，出现了超越万份以上的研究论文。

1992年一氧化氮被科学杂志推举为“本年度明星分子”。

1998年诺贝尔的生理医学奖项颁给福察哥（Furchgott）、伊那罗（Ignarro）、和慕拉（Murad）三位美国科学家，为了奖励他们在一氧化氮（Nitric Oxide）方面的研究。

他们发现一氧化氮是一种气体，在人体内扮演着传递重要讯息和调节细胞功能的角色。这个震惊各界具有革命性的发现证实了：一氧化氮能促进血液循环。这是人类前所未有的发现。

1998年诺贝尔生理医学奖得主路易斯博士认为：解决心脑血管疾病的唯一途径是提升体内的一氧化氮。

一氧化氮的作用主要有：

1.保持维护心脏冠状动脉的畅通。

2.防止过多的凝血块阻塞,造成心脏病、中风。

3.放松动脉（维持正常血压所需）。

4.帮助脑部血液流通以增强记忆力。

5.提高血液流量，增强男性功能。

6.缩小和消灭癌症肿瘤。

7.降低胆固醇和防止LDL（坏胆固醇）氧化。

8.预防痔疮及帮助其愈合。

9.预防一般的肺部疾病。

10.帮助调节胰岛素分泌。

11.消灭外侵的细菌和病毒。

一氧化氮的神奇功用：

有了一氧化氮，跟高血压、糖尿病说BYE BYE

有了一氧化氮，跟脑中风、老人痴呆症说BYE BYE

有了一氧化氮，跟男、女性功能障碍说BYE BYE

有了一氧化氮，跟心血管疾病、胆固醇说BYE BYE

事实证明:

一氧化氮是最佳的血管清道夫！

一氧化氮有效地降低低密度脂蛋白！

一氧化氮让您享受美食没有后顾之忧！

ForMor的配方，能够仅以最少量的阿基宁配合一组由营养物组成的超级协同队伍，就可以在体内合成一氧化氮。

雷雨发庄稼

轰然半空天龙来，氮氧瞬触作潇潇。

一氧一氮半空飘，伴氧又作二氧瞧。

水汽熏得春风来，固氮一刻洒酸硝。

入土又作春泥肥，万亩良田品良肴。

感觉上诗问题颇多，于是有作一篇：

天公掌碎云成絮，风正飘袅雨正潇。

水汽半空春风里，巧遇氮氧洒酸硝。

春泥护植千秋夸，硝盐作食万年肴。

固氮神通仍犹存，一份氮来氧又到。

初中就学过浓硫酸，浓硫酸留给学生的印象并不好，是与可怕等同，提起要学习浓硫酸，学生大多是一阵唏嘘，作手拿书本掩面状。我想，这与学生首次学习浓硫酸时被老师出于安全考虑而夸大其危险性的讲授有关。实际上，浓硫酸在中学化学实验室里并不是最危险的药品，浓硫酸在工业生产中具有广泛应用，高中需要为浓硫酸正名。 浓硫酸性质中有两个实验让学生惊叹。一个是浓硫酸使蔗糖发黑“面包”，一个是浓硫酸跟铜反应。

先说第一次惊叹。取蔗糖盛放在小烧杯中，滴加几滴水，加入适量的浓硫酸。白色的蔗糖瞬间转变为棕褐色继而转变成黑色，用玻璃棒不断搅拌，蔗糖由黑色颗粒变成黑色稠状，继而变糊状，此时，温度骤然升高，放出刺激性稍带甜味的气体，此时，反应越来越剧烈，放出大量焦味的刺鼻的白雾，停止搅拌，轻轻地提起玻璃棒，黑色稠状物变成不断膨胀的黑色固体“面包”，充满了气孔。实验在学生的一阵惊叹中结束。

这次惊叹，多数是出于对实验现象的强烈震撼力，惊叹于浓硫酸神奇的魔力。颜色的变化、气体的变化、状态的变化、黑色“面包”的形似，都出乎学生意料，像魔术变幻。 再说第二次惊叹。浓硫酸与铜反应后，试管中淡蓝色的溶液中出现白色的硫酸铜粉末。打开窗帘，阳光恰好照到试管中，白色的硫酸铜粉末刹那间反射出耀眼的光线，就像黑暗中闪烁的星光。学生一阵惊呼，太美了，我也陶醉其中，与学生共同欣赏这一偶得的奇观。

一个预设中的实验现象，一个碰巧生成的实验现象；一个预料中的惊叹（以前的学生在

观察这一实验时都是如此），一个未曾想到的惊叹，是化学实验美的一种诠释。化学课堂应让学生感受到美而不仅仅是恐惧，对化学药品的认识也不能局限在其危险性、危害性，还应还原其与人类文明息息相关的重要作用。

学生对化学的厌恶，对化学药品的恐惧，把环境污染归结为化学学科的现象并不少数，而真实的化学并非如此。我们有必要让学生领略到化学带来的进步，欣赏到化学带来的美丽。这些，其实是我们能够做到的。不夸大化学药品的伤害性，造成伤害是因为人为操作不当而不是化学药品本身，了解化学药品的危险性目的是为了更好地利用和防范而不是躲避。把实验做得规范一些，做得“绿色化”一些，引领学生欣赏化学实验的奇、变、美。

反应具有可控制性，可根据需要随时停止反应，避免药品浪费和环境污染。

2、此装置可重复使用。

3、由于用品红试纸取代了品红溶液，反应见效快，缩短了实验时间，同时产生的SO2气体也大大减少，能被干燥管中的棉花完全吸收，避免环境污染。

4、反应后的溶液蓝绿色很明显，几乎没有黑色，稀释后溶液蓝色明显，效 实验装置图：

教学过程