蛋白质和酶思考题

蛋白质工程和酶工程复习思考题

仅供参考

1. 培养基包括哪五大要素？

水、碳源、氮源、无机盐、生长因子

2. 酶生物合成模式有哪几种，各有什么特点，其示意图是怎样的？

(1)同步和成型（生长偶联型）：其生物合成伴随着细胞的生长而开始，在细胞进入旺盛生长期时。酶大量生成，当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。

特点：酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止；酶所对应的mRNA 很不稳定。

(2)延续合成型：酶的生物合成在细胞生长阶段开始，在细胞的生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间

特点：酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；酶所对应的mRNA 相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长时间用于酶的合成。

（3）中期合成型：酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期后，酶的生物合成也随着停止。

特点：酶的合成受到反馈阻遏；所对应的mRNA 不稳定。

（4）滞后合成型（非生长偶联型）：酶在细胞生长一段时间后或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累

特点：在对数生长期不合成酶（可能是受到分解代谢物阻遏的影响）；所对应的mRNA 稳

定性高。

3. 凝胶电泳常用的电泳介质有哪些？

聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶

4. 化学修饰的常见氨基酸及其侧链基团各有哪些？

氨基(赖氨酸残基) 、羧基（谷氨酸、天冬氨酸残基）、羟基（丝氨酸、苏氨酸残基）、巯基（半胱氨酸残基）、胍基（精氨酸残基）、酚基（酪氨酸残基）、咪唑基（组氨酸残基）、吲哚基（色氨酸残基）、甲硫基（甲硫氨酸残基）

5. 生物传感器与普通传感器的最大区别是什么？

最大区别在于生物传感器的感受器中含有生命物质。

6.

7. 在各种梯度离心中，常用的梯度介质分别有哪些？密度梯度离心：蔗糖溶液（5%~60%）；等密度梯度离心：CsCl

Michaelis 和Menton 表述的酶作用的普通理论是什么？

米氏方程。他们假定酶（E ）首先和底物（S ）结合，成为酶-底物混合物（ES ）, 这是一个较快的可逆过程。然后复合物（ES ）在下一个较慢的反应中分解成产物（P ）和游离的酶。

8. 水解酶的化学反应通式是什么？

AB+H2O AH+BOH

9. 硫酸铵分级沉淀中，饱和度如何表示？

10. 哪种固定化方法一般不会影响底物的专一性。

物理吸附法、离子结合法、包埋法

11. 常用的外源基因的表达系统有哪些，各自优缺点是什么？

（1）大肠杆菌表达体系：

优点：遗传学和生理学背景清楚，易培养，外源基因常可高效表达

不足：不可进行典型的真核细胞所具有的翻译后修饰。

（原核表达系统的优缺点：细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏。）

（2）酵母表达系统

优点：酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。

缺点：它的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。

（3）昆虫杆状病毒表达系统

优点：

①重组蛋白具有完整的生物学功能

②能进行翻译后的加工修饰：糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等

③表达水平高：能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％

④能容纳大分子的插入片段（约10kb ）：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段

⑤同时表达多个基因

杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体

⑥适合表达细胞毒性蛋白

⑦安全

家蚕等昆虫属无脊椎动物，与人类的亲缘关系较远，且重组NPV 无多角体蛋白形成，病毒粒子极易在自然环境中失活

不足：①非连续性表达重组杆状病毒能导致宿主死亡

②产物糖基化相对简单糖侧链甘露糖成分高，缺乏复合寡糖

（4）哺乳动物细胞中的表达系统

优点：哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。缺点：组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。

12. 双向电泳第一、二向是依据什么原理分离蛋白质？

双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE 分离。

13. 在酶的分离纯化过程中，酶的总活力与比活力的关系如何？

评价一种分离纯化方法优劣的指标主要有3个：总活力的回收率、比活力提高的倍数和重现性。总活力的回收率指纯化后样品的总酶活占纯化前样品总酶活的百分比，回收率越高，说明纯化过程对酶活的影响越小，导致的酶活损失就越小。比活力是指在特定的条件下，毎mg 酶蛋白所具有的酶活力单位数，是反映酶催化性能的一个重要参数，比活力提高的倍数即纯化后样品与纯化前样品的比活力的比值，较大的提高倍数说明纯化后酶的比活力有了显著提高，即表明了纯化方法的有效性。而较好的重现性则是衡量纯化方法是否可行的必要条件，它要求操作材料有较高的稳定性，且操作条件要易于控制。

14. 常见的体外翻译系统有哪些？

兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、原核体外翻译系统(E ．Coli S30)

15. 蛋白质组学的研究技术主要有哪些?

双向电泳技术（2DE ）、计算机图像分析与大规模数据处理技术、质谱技术(MS)

16. 酶的专一性分为哪两类？

结构专一性、立体异构专一性

17. 冷冻电镜三维重构的基本原理及技术路线。

基本原理是通过对相同的生物大分子某方向的投影显微像在时空中经调整后进行叠加，从而提高信噪比，最后将不同投影方向的单颗粒显微像在三维空间进行重构获得单颗粒大子。（指通过样品的一个或多个投影图得到样品中各组成部分之间的三维关系。）

技术路线：

利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定，然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像，利用高灵敏底片进行成像记录，利用高分辨率扫描仪对底片进行数字化，对数字化的图像进行二维图像分析——选点、分类、校正和平均，最后完成样品的三维重构计算

18. 酶的特征性常数有哪些？

Km

19. 第一次国际酶工程学术会议主题和内容是什么？

主题：固定化酶的研制和应用

内容：

20. 常用于判断透析是否完全的试剂有什么？

21. 在设计蛋白质二级结构时，各有哪些可供参考选用的氨基酸？

设计α螺旋时，应选择象Leu 、Glu 等易于形成α螺旋的残基；设计全β结构时，应选择Val 、Ile 等易于形成β折叠片的残基；而在设计转角时常选择Pro-Asn 残基对。

22. 最适含水量的定义是什么？

在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。

23. 维持蛋白质空间构象的作用力有哪些？

一级结构：肽键、二硫键（都属于共价键）

二级结构：氢键（主链上—C=O—和N—H之间形成）

三、四级结构：二硫键、次级键（氢键、疏水键、离子键、范得华力、配位键）

24. 蛋白质的变性与复性。

天然蛋白质因受到物理和化学的因素影响，使蛋白质严格的空间结构受到破坏，（但不包括肽键的裂解），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质变性作用。

变性的蛋白质恢复其天然活性的现象称为复性

25. 什么叫做蛋白质的等电点？

使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的pH 值称为PI(isoelectricpoint).

26. 亲和标记试剂的作用原理。

亲和性标记试剂是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物。与天然底物或配体竞争蛋白质分子的结合位点。这类试剂具有高度的位点专一性。

27. 简单了解蛋白质的各种染色方法及优缺点。

（1）考马斯亮兰（Coomassiestain）

考马斯亮蓝检测范围30-100ng，灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长（24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便。

（2）银染（SilverStain ）

银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。

（3）荧光染色（SYPRORuby protein gel stain）

SYPRO Ruby 染料

⏹灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色

⏹染色所需时间较短

⏹染色的动态线性范围大大优于胶体金染色，扩展了约1000倍。

⏹荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，不干扰质谱或免疫检测过程

Cy3和Cy5

⏹两种染料可分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，在一块2-D 胶上同步运

行，可以很方便的找出差异

⏹但因其需要对蛋白质进行共价修饰、改变了标记蛋白质的移动性能

⏹由于荧光探针猝灭作用会引起快速衰减。蛋白与蛋白之间由于可被荧光团修

饰的功能基团数目不同而使得灵敏度变化很大

⏹荧光团的加入会降低蛋白质溶解性能。

（4）负染

28. 酶的竞争性抑制剂的动力学特点有哪些？

I 与S 分子结构相似b、Vmax 不变，表观Km 增大；c、抑制程度取决于I 与E 的亲和力，以及[I]和[S]的相对浓度比例。

29. 表达蛋白质组学与差异蛋白质组学的概念。

表达蛋白质组学：即把细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱，或扫描EST 图，试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。

该方法具有能够确定蛋白质量和检测到转录后修饰的优点。可以获得某种条件下的样品的蛋白质表达图谱，这样就能够进行比较蛋白质分析，从而在分子水平上阐明一些疾病发病机理，有利于疾病的诊断及治疗。

差异蛋白质组学：主要通过比较分析不同状态下细胞或组织蛋白质表达图谱，发现与特定生理病理状态密切相关的差异表达蛋白，从而阐明特定生理病理状态产生的本质规律。

30. 固定化酶的作用pH 会发生变化吗，为什么？

会发生变化。

（1）载体电荷性质对最适pH 值的影响（微环境表面电荷的影响）：一般说来，带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH 值较游离酶偏高，反之，使用带正电荷的载体其最适pH 值向酸性偏移

（2）产物性质的影响：当产物为酸性时，固定化酶的最适pH 值比游离酶要高些。反之，，则低。中性产物，对其影响不大。

31. 常用的定向进化的技术有哪些，基本原理是什么？

❑易错PCR（Errorprone PCR）

它通过改变PCR 反应条件，如降低一种dNTP 的量（降至5%-10%）、以dITP 来代替被减少的dNTP、增加Mn2+和Mg2+的浓度或使用低保真度的DNA 聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。

❑DNA 搅乱重组（DNAshuffling）

单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA 片段。无引物PCR ，具有互补3’末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR 循环在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物，这些重排产物的集合被称为突变文库。对突变文库进行筛选，选择改良的突变体进行下一轮的shuffling 循环，重复多次重排和筛选，直到最终获得性状比较理想的突变体。

32. 蛋白质溶解度与温度的关系。

33. 双水相萃取的概念及原理。

双水相萃取就是利用样品中各组分的在两种互不相容的双水相中液层中分配系数的不同实现分离目标组分的一种技术。

34. 亲和层析、离子交换层析、凝胶层析各自原理。

亲和层析：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化。

离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。

凝胶层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离。

35. 何谓蛋白质工程？

以蛋白质的结构和功能为基础，通过基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术。

36. 蛋白质免疫印迹实验的大致流程。

蛋白质免疫印迹主要包括三个步骤：第一步是凝胶电泳；第二步是转膜，把凝胶上的蛋白质条带转移固定到薄膜上；第三步是抗原抗体显色反应。

37. 肽键是如何形成的？

氨基酸之间脱水后形成的键为肽键，也为酰胺键

1H 2N +2H 12N 2肽键

38. 和酶催化相关的有些什么因素？

底物浓度、产物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂

39. 怎样根据酶、底物、产物特性以及操作条件和操作要求的不同来进行选择？

1、根据酶的应用形式选择

（1）游离酶反应器的选择

a. 常用搅拌罐式反应器。酶难于回收。对于具有高浓度底物抑制作用的酶，采用流加式分批反应，可以降低或消除高浓度底物对酶的抑制作用。

b. 有气体参与的，采用鼓泡式反应器。既具搅拌作用，又可带走产物，以降低或消除产物对酶的反馈抑制作用。

c. 价格较高的游离酶，可采用游离酶膜反应器。

d. 耐高温的酶，如高温淀粉酶，采用喷射式反应器，进行连续式的高温短时反应。

（2）固定化酶反应器的选择

根据固定化酶的形状、颗粒大小和稳定性的不同，进行选择。

机械强度稍差的固定化酶，主要搅拌桨叶旋转产生的剪切力会对固定化酶颗粒产生

损伤甚至破坏。

主要有搅拌罐式反应器、固定床式反应器、流化床式反应器、鼓泡式反应器、膜反

应器等。

2、根据酶反应动力学性质选择反应器

（1）保证酶与底物的充分结合

（2）底物浓度的高低对酶反应速度的影响

分批搅拌罐式反应器，游离酶膜反应器

（3）产物对酶有反馈抑制作用的。

膜反应器、填充床式反应器

（4）耐高温酶

喷射式反应器

3、根据底物或产物的理化性质选择反应器

（1）反应底物或产物的分子质量较大时，由于底物或产物难于透过超滤膜的膜孔，一般不采用膜反应器。

（2）反应底物或产物的溶解度较低、黏度较高时，应当选择搅拌罐式反应器或流化床式反应器，而不采用填充床式反应器和膜反应器，以免造成阻塞。

（3）反应底物为气体时，通常选择鼓泡式反应器。

（4）有些需小分子物质为辅酶的催化反应，通常不采用膜反应器，以免辅酶的流失而影响反应进行。

（5）所选反应器应当能适用于多种酶的催化反应，满足酶催化反应所需的各种条件，并可进行适当调节控制。

（6）反应器应尽可能结构简单、操作简便、易于维护和清洗。

（7）反应器应具有较低的制造成本和运行成本。

40. 影响酶生物合成模式的主要因素有哪些？

酶所对应的mRNA 的稳定性、培养基中阻遏物的存在

41. 蛋白质分子设计的种类及其特点。

1、定点突变或化学修饰法

“小改”：即通过对目标蛋白质进行定位突变或化学修饰改变其结构和功能。

2、拼接组装设计法

“中改”：即通过对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接和组装，从而较大程度的改

变其结构和功能。

3、从头设计全新蛋白质

“大改”：即完全从头设计出一种具有特异结构与功能的全新蛋白质。

42. 用于解析蛋白质三维空间结构常用的方法有哪些，简述其基本原理？

蛋白质三维结构分析的主要方法有X-射线晶体衍射法和核磁共振法

X 射线衍射分析所依赖的基本原理是X 射线衍射现象。X射线衍射现象利用X 射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。当X 射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X 射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。

核磁共振(NuclearMagnetic Resonance)原理，就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。

43. 蛋白质等电点与环境p H 是如何决定蛋白质的带电状况的？

p H>pI，蛋白质带负电；p H

44. 基因突变时对蛋白质进行改造可根据改造策略的不同分为哪两类主要技术？

定点突变、定向技术

45.

各类过滤方法的截留分子大小范围是什么？

46. 固定床式反应器适用的底物类型。

把催化剂填充在固定床（填充床）中的反应器叫做固定床型反应器。

优点：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR 是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。

缺点：传质系数和传热系数相对较低，如加上循环装置后，可适当改善。

47. 酶固定化中共价结合法对载体的一般要求是什么？

1. 一般情况下尽量选择亲水性强的载体

2. 载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度

3. 载体必须有在温和的条件下与酶共价结合的功能基团

4. 载体没有或很少有非专一性吸附

5. 载体容易获得，并能反复使用

48. 生物质谱分析的基本原理。

生物质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异

化来分离并确定分子质量。它具有高通量、灵敏、准确、自动化等特点，已逐步取代传统的Edman 降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术，已广泛应用于二维电泳、色谱分离的蛋白质，以及蛋白质复合体的鉴定。

49. 蛋白质含量测定的经典方法有哪些，各自原理大致是什么？

（1）最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依据是蛋白质平均含氮量为16%，假设测得样品中的含氮量为1g，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为1/16%=6.25g。

（2）紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分别测定样品在280nm 和260nm 的光吸收值，利用经验公式，蛋白质浓度（mg／mL）＝1.45×A280nm－0.74×A260nm，很容易计算出样品的蛋白质含量。

（3）分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量。

50. 生物传感器的种类及其分类依据。

（1）按照其感受器中所采用的生命物质分类，可分为：微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、细胞传感器、酶传感器、DNA 传感器等。

（2）按照传感器器件检测的原理分类，可分为：热敏生物传感器、场效应管生物传感器、压电生物传感器、光学生物传感器、声波道生物传感器、酶电极生物传感器、介体生物传感器等。

（3）按照生物敏感物质相互作用的类型分类，可分为亲和型和代谢型两种

51. 酶固定化常用方法有哪些？

包埋法：微囊法,网格法

化学结合法：交联法,共价结合法

非共价结合法：结晶法,分散法,物理吸附法,离子结合法

52. 盐析、盐溶的定义

盐析：向酶蛋白溶液中加入中性盐，当盐溶度达到一定界限时，酶蛋白的溶解度会随着盐溶度的升高而继续下降并析出沉淀的现象。

盐溶：蛋白质在低溶度盐溶液中，其溶解度会随着盐溶度的升高而增加的现象。

53. 诱导酶的发酵生产中在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加，一般分为哪

三类？

酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物

54. 超临界流体的特点有哪些？

密度接近液体－－萃取能力强，粘度接近气体－－传质性能好。超临界流体萃取是利用流体在超临界状态时具有密度大、粘度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。它具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。

55. 反胶束萃取的基本原理及其应用

反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。

当蛋白质样品和反胶束混合时，由于反胶束溶液表面和蛋白质表面的相互作用，在两相界面形成了包含蛋白质的反胶束团，此时蛋白质以最大速度扩散进入反胶束中，从而实现蛋白质的正萃取。然后，含有蛋白质的反胶束与另一水相接触，通过改变水相条件（如pH 、离子强度等），可以调节蛋白质反萃回水相，从而实现正萃取或反萃取过程，回收目的蛋白质。

应用：

56. 酶促反应一般环境条件。

酶促反应一般是在常温、常压、适宜的等温和条件下进行。

57. 蛋白质提取过程中去污剂的作用是？

可消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其pI 等电点处的溶解性。

58. 原核细胞的启动子有何特征？

−10区（TATAAT）RNA聚合酶结合位点，−35区（TTGACA）RNA 聚合酶识别位点，−10区和−35区之间的距离为17bp 时转录效率最高