台湾青枣不同品种表型差异和遗传多样性研究

第16卷第2期2009年2月

现代农业科学M odern Agricultural Sciences

Vol.16No.2Feb.2009

台湾青枣不同品种表型差异和遗传多样性研究

卓书斌1，黄小凤1，袁志永1，王峥峰2，曹洪麟2

（1. 广东省东莞植物园，广东东莞523086；2. 中国科学院华南植物园，广东广州510650）摘

同时使用ISSR 分子标记技术对要：对台湾青枣9个品种的15个形态指标进行了统计分析，

从而确定台湾青枣形态特征与遗传差异的关系。结果表明：这些其进行了基因组DNA 多态性分析，

形态指标均达到明显的差异。用筛选出的10条能获得多态性高、重复性好、清晰位点的引物对100份DNA 样品进行PCR 扩增，每个引物可以扩增出3～8条带，这些DNA 片段大小主要集中在250～2000bp ，从明显的多态性位点可以得知该品种种质资源之间遗传多样性很低，同时也说明了台湾青枣的不同品种是可以用分子标记的技术来分析和鉴定的。

关键词：台湾青枣；ISSR ；表型差异；遗传多样性S665.1中图分类号：

文献标识码：A

文章编号：1005-4650（2009）02-0013-04

Study on the Phenotypic Difference and Genetic Diversity of Different Cultivars of Taiwan Green Jujube

ZHUO Shu-bin 1, HUANG Xiao-feng 1, YUAN Zhi-yong 1, WANG Zheng-feng 2,CAO Hong-qi 2

(1.DongguanBotanical Garden, Dongguan, Guangdong 523086, China; 2. South China Botanical Garden, Chinese Academy

of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510650, China)

Abstract:The study makes a statistical analysis for 15morphological indexs of 9different cultivars of Taiwan green jujube, and in-ter-simple sequence repeat (ISSR)method was used in analyzing the genetic diversity of these cultivars to determine the relationship of morphological characteristics and genetic difference of Taiwan green jujube. The result showed that these morphological indexs were ob-vious differences. 100DNA samples were amplified using ten random PCR primers of high reproducible,clear and stable quality which were screened from sixty primers, every primer had 3to 8bands most of the bands were from 250to 2000bp, it was concluded from ob-vious polymorphic loci that the genetic diversity was very low in different idioplasmic sources of green jujube, at the same time, different cultivars of Taiwan green jujube could be analyzed and identified by M olecular M arker Technique.

Key words:Taiwan green jujube; ISSR; phenotypic difference; genetic diversity 台湾青枣（Zizyphus maurltlans ）是中国台湾省选育的单果重5O g 以上的毛叶枣优良品种群。目前已广泛种植于我国的云南、海南、广东及广西等省、自治区。由于台湾青枣具上市季节好、易于栽培管理等优势，所有投产快丰产稳产、

以推广迅速，也受到业内人士的关注，但目前对台湾青枣的研究多限于引种技术、栽培技术、管理技术和病虫害防治等方面。该种的品种间具有一定的形态特征差异，传统使用形

3]

孢粉学[2，、细胞学[4]等方法能区分部分种质资源，但态学[1]、

fied Polymorphie DNA ）、RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphisma ）、AFLP （Amplified Fragment Length Polymor-phism ）等技术相继应用于果树品种鉴定和亲缘关系分析上。但这些方法都有一定局限性，如RAPD 虽然操作简单，但由于引物序列较短、退火温度低，所以重复性难以保证；而RFLP 和AFLP 步骤繁琐，技术要求高，成本高，所以也难以广泛应用。ISSR(inter-simple sequence repeat) 标记是由Zi-它操作简单、标记重复性etkiewicz 等提出的一种标记技术，

好、多态性丰富、实验稳定性高。因此ISSR 是快速、可靠、可以提供基因组丰富信息的DNA 指纹技术，该方法被广泛用于品种鉴定、多样性分析、指纹图谱的构建等研究中。目前ISSR 技术对果树进行遗传多样性研究已有较多报道，但采用分子标记技术对枣树（特别是台湾青枣）的遗传多样性和

其结果易受环境饰变影响，或多态性低，应用范围受到局限。随着分子生物学的发展，分子标记技术已越来越广泛地应用于果树品种鉴定和亲缘关系分析上。分子标记的多态性好，且不受环境的影响，是基因组DNA 水平差异的直接反映。目前已经有DNA 分子标记如：RAPD （Random Ampli-

收稿日期：2009-01-13

基金项目：广东省国际合作项目(2003C50208)；台湾水果新品种引进及标准化栽培示范通讯作者：曹洪麟

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现代农业科学2009年

居群结构的遗传结构进行研究目前尚少有报道。仅有彭建营等和吴臻分别对枣种质资源进行了RAPD 分析，王永康等对枣树品种品系的AFLP 分析。

台湾青枣主要是通过嫁接繁殖和推广，其品种形成多为由芽变产生，形态特征受环境因子影响较大，所以利用形态特征和分子标记手段相结合来对种质资源的鉴定和亲缘关系分析具有重要意义。本实验为了能更加深入的了解和掌握台湾青枣的一些基本特征，对不同品种的台湾台湾青枣的形态指标进行了统计分析，并使用ISSR 分子标记技术对其进行了基因组DNA 多态性分析，进而确定台湾青枣形态特征与基因多样性的关系。

从哥伦比亚大学公布的上海基因公司合成的60条IS-SR 引物中筛选出10条能获得多态性高、重复性好的清晰位点的引物对所有个体进行PCR 扩增。扩增反应在美国M J 公司PTC 一200扩增仪进行。PCR 扩增条件：95℃预变性5min ，94℃变性45s ，45～52℃复性45s(依引物不同而改变) ，72℃延伸45s ，35个循环之后72℃反应10min 。反映体系如表1所示。

表1

反应物ddH 2O 10×buffei dNTP （10mM ）（10ng/μL ）DNA

引物（10μM ）Taq （5∪/μL ）总体积

反应体系

每PCR 管体积/μL

6.31.00.32.00.20.210.0

1

1.1

材料与方法

台湾青枣采样点的概况

采样点地位于东莞植物园的农业引智示范基地（现为东

莞市农业科技园区），毗邻水濂山，东经113°45′，北纬22°57′, 占地面积6.667hm 2。

1.5电泳检测和结果统计

PCR 产物经电泳分离、染色显示后进行谱带观察、统

1.2形态特征的收集

供试台湾青枣于3月份嫁接，5～12月每月下旬，调查

计。PCR 产物在浓度1.5％的琼脂糖胶上进行电泳分离后用锈化乙啶(EB)染色，在KODAK 2000R 凝胶成像系统下进行观察，统计带的有无及相对位置并做好记录。

各品种选择生长势相近的标准株5各品种的枝稍生长情况。

株，挂牌标记，调查各结果主茎的枝长、茎粗、分枝数及植株的冠幅，结果取平均数。枝长：嫁接口至结果主茎枝稍顶端的长度；茎粗：结果主茎离嫁接口10cm 处的直径；分枝数：结果主茎的一级分枝数。冠幅：整株青枣的枝条伸展的长度（东随机抽取10西向）和宽度（南北向）的乘积。对各青枣品种，个结果主茎，摘取结果主茎基部的第2片叶，量叶片的长度和宽度，叶面积=叶片长度×宽度。摘取各品种的成熟果实各10个，用游标卡尺量果实的长度和宽度，果形指数=长度/宽度。采收各品种的成熟果实各20个，送往华南农业大学园艺学院广东省果蔬重点试验室分析。

2

2.1

结果与分析

台湾青枣具有明显的形态特征

表2是对9个青枣品种的营养生长指标的调查结果，通

过比较发现：粤引大脆蜜和新世纪的枝长、分枝数、茎粗及冠幅等营养生长指标都较大，表现为树型粗壮，其次是蜜丝、五千、高朗、长蜜丝和翠蜜，天王蜜的营养生长指标最小，因而株型最小。营养生长是生殖生长的基础，强壮的树体是获得高产的性状之一，本试验中，从株型的角度看，粤引大脆蜜和新世纪获得高产的潜力很大。另一方面，株型的大小，也是种植密度的一个重要参考值，如：对于株型较小、分枝较弱的品种，可加大种植密度，增加每株结果主茎的数量。此外，叶片性状是青枣品种的一个重要特征，叶面积还是光合作用的一个重要指标，从表2可看出，粤引大脆蜜是一个典型的大叶但进入生殖品种，在营养生长期，其叶片是其它品种的2倍，期，其叶片逐渐减小，但仍大于其它品种，高朗3号的叶面积也较大，而翠蜜的叶面积最小。

1.3样品采集和DNA 的提取

于东莞植物园台湾青枣园实验基地选取以下品种：蜜丝

（A ），野生毛叶枣（B ），五千（C ），粤引大脆蜜（D ），天蜜（E ），新世纪（F ），翠蜜（G ），长蜜丝（H ），高朗3号（I ），天王蜜（J ）。每品种10株个体，每株采集新鲜叶片5～10片放入封口袋中，当天带回华南植物园实验室，在4℃冰箱黑暗饥饿3d 后采取改良的CTAB 法提取DNA

1.4PCR 的扩增

表2

品种

粤引大脆蜜

4.09

9个青枣品种营养生长指标的比较1）

五千3.6619.084.6747.32100.02

高朗3号3.5619.004.6438.92116.83

长蜜丝3.3718.153.4636.0689.36

翠蜜3.0819.253.8829.7974.44

天王蜜3.0612.252.9627.9495.04

天蜜3.2614.413.2331.4269.63

新世纪4.1418.715.3651.9898.48

蜜丝3.9619.394.1151.0088.22

枝长/m分枝数/个茎粗/cm 冠幅/m2叶面积/cm2

19.135.3653.78211.47

1）：野生毛叶枣（B ）的资料收集不全。

第2期台湾青枣不同品种表型差异和遗传多样性研究

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如表3所示，从平均单果重来看，粤引大脆蜜果型最大，其次是翠蜜、高朗3号和天蜜，蜜丝最小，长蜜丝、五千和天王蜜；从可溶性固形物来看，粤引大脆蜜最甜，其次是天蜜、蜜丝、五千长蜜丝和翠蜜，天王蜜糖度最小（由于取样时天王蜜还未进入成熟期，测量结果偏小，实际上天王蜜糖度可达14度）；从可滴定酸来看，五千酸度最大，翠蜜最小；Vc 含量，长蜜丝最高，其次是蜜丝、新世纪、粤引大脆蜜、天蜜，五千最小；从果肉厚度来看，天王蜜、粤引大脆蜜、翠蜜果肉较厚，五千最薄；各品种的含水量差别不明显。综合各

108g ，在台湾俗称“九两”，即果重可达350g ，大陆引种栽培最大果重也达到了250g ，其果大，糖度高，酸度中等，风味好，外观品质优良，可打造成为高质高品味的精致水果；果实品质优良的品种还有蜜丝、长蜜丝、翠蜜和高朗3号；天王蜜、天蜜、新世纪由于皮厚有渣，新世纪果肉较松软，天蜜入口时果皮带有薰衣草香味，较不易被消费者接受，但天蜜去皮后品质佳，而五千的口味较淡，品质一般。从单株年产量来看（丰产期产量），新世纪和大脆蜜产量较高，这与2种品种树势强健有关。

性状，粤引大脆蜜的特点是果大，本试验的平均单果重为

表39个台湾青枣果实产量和品质分析结果

指标品种

单果重/g 108.1471.3677.1977.7283.7893.9273.0292.07

可溶性固形物/%16.1013.7014.0010.1012.9012.9013.1011.20

可滴定酸/%0.821.171.410.981.170.961.100.72

Vc/(mg/100g) 31.2034.5024.9027.3033.0026.1038.4027.00

含水量/%84.1084.6083.2086.8084.4085.6082.9086.40

果形指数(长/宽) 1.211.141.180.961.221.171.151.20

果肉厚度/cm1.971.501.332.031.671.601.761.93

丰产期

风味

外观品质

单株年产量/kg

脆甜，化渣，浓郁蜂蜜香气

椭圆形，果皮光滑、翠绿

粤引大脆蜜[***********]

蜜丝五千天王蜜新世纪高朗3号长蜜丝翠蜜

脆甜，化渣，浓郁蜂香气

仿锥圆形，果皮光滑、鲜绿

果皮光滑、鲜绿脆，清甜，化渣，微带蜜味椭圆形，

脆爽，皮厚有渣，有蜂蜜香气

扁圆形，果皮光滑、翠绿

不脆，皮厚有渣，微带酸

椭圆形，果皮微凹凸、鲜绿

脆甜，化渣，微带蜜味

脆甜，化渣，浓郁蜂蜜香气

椭圆形，果皮微凹凸、鲜绿

椭圆形，果皮光滑、鲜绿

脆爽，清甜，化渣，微带蜜味椭圆形，果皮光滑、翠绿

天蜜90.9914.601.1731.2082.901.201.50

脆甜，皮厚有渣，浓郁蜂蜜香气，果皮有薰衣草香味

椭圆形，果皮光滑、

鲜绿

80

1）：野生毛叶枣（B ）的资料收集不全。

2.2台湾青枣遗传多样性水平分析

用筛选出的10条引物（UBC807、UBC810、UBC811、

性很低（图1、2），811的引物所扩增的结果表明，10个品种之间基因组DNA 多态性很相近；而810引物扩增表结果表明，10个品种之间基因组DNA 多态性是有差异的，但只有天王蜜（J ）和其它品种有明显的差异。从结果可知台湾青枣品种的遗传变异很小，其主要原因是：台湾青枣的主体亲本少；另一方面，由于育种目标一致，造成某些基因的定向选择，导致优良性状集中于少数材料上，而许多非育种目标的多样化性状丢失。此外，台湾青枣主要以嫁接的方式来繁殖和推广，所以引入的外源基因较少，因此变异较小，基因型相似性较高。

UBC825、UBC835、UBC836、UBC841、UBC842、UBC861、UBC864）对100份DNA 样品ISSR 扩增，扩增条带清晰，每个引物可以扩增出3～8条带，这些DNA 片段大小主要集中在250～2000bp(图1、2、3) 。其中只有836、842、864、3条引物能扩增出明显的多态位点，这表明ISSR 技术是能鉴定台湾青枣品种的依据。但其余的引物多态位点较低，811引物几乎没有多态位点。所以从整体来看，台湾青枣种质资源之间遗传多样性很低。

3讨论与结论

本研究对9个台湾青枣品种的15个营养生长、产量和

品质性状进行了调查统计，结果表明不同品种的台湾青枣有2）。但由于表型是环境和基因型互作丰富的形态差异（表1、的结果，有些表型的变化受环境影响较大，受遗传控制较小，因此单采用形态学或分子遗传标记研究种质资源的亲缘关系是具有一定的局限性。

从ISSR 的结果来看，台湾青枣种质资源之间遗传多样

M 为M arker ，1~2为A 、3~4为B 、5~6为C 、7~8为D 、9~10为E 、11~12为F 、13~14为G 、15~16为H 、17~18为I 、19~20为J 。

图1引物811ISSR-PCR 扩增结果

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图2引物810ISSR-PCR 扩增结果图3引物836ISSR-PCR 扩增结果

）可看出，引物836扩增的结果具有明显的多态从（图3

性，10个品种中，蜜丝（A ）和野生毛叶枣（B ）具有相近的基因粤引大脆蜜（D ）和天王蜜（J ）也具有相近的组DNA 多态性；

基因组DNA 多态性；其余的五千（C ）、天蜜（E ）、新世纪（F ）、翠蜜（G ）、长蜜丝（H ）和高朗3号（I ）属于一类。结果表明，ISSR 标记技术能区分部分供试材料，可用台湾青枣种质多样性的遗传研究；另一方面，台湾青枣种质资源在分子水平上存在遗传差异，但是遗传多样性较低。因此在今后的育种工作中要积极引入外源基因，创造优质种质资源，拓宽种质的遗传基础。

208-212．

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参考文献

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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

（上接第2页）

3

3.1

讨论

银杏种子的贮藏行为

许多热带和亚热带的林果种子，例如木菠萝、橡胶、芒

传统观念认为，银杏种子有休眠期，而层积处理可以打破休眠。但从本试验结果看，2个银杏品种种子收获加工后发芽率都达85%以上，表明银杏种子无明显的休眠期。而新种子发芽率较低的原因，主要是无胚率高；贮藏或层积后熟并不能降低无胚率。另有报道认为，银杏种子的无胚率有些可能高达50%。关于银杏种子无胚率高的原因及其影响因素，有待进一步研究。

龙眼、荔枝、榴莲等植物，由于它们的种子在贮藏过程中，果、

既不耐低温，也不耐干燥，当种子含水量低于一定值时，发芽力便迅速下降；即使把它们贮藏在潮湿环境中，其寿命仍然很短。通常人们称此类种子为顽拗性种子，属于短命类种子。但是，对于银杏种子属于正常性种子还是顽拗性种子目前还当含水量降至30%没有一个定论。从本试验的研究结果看，

时，龙眼和梅核的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别降至8.7%、6.2%、4.33、3.87和12.6%、10.6%、4.1、3.46。当含银杏种子几乎全部死亡。说明银杏种子具水量降至10%时，

有不耐脱水的特性。但是和热带、亚热带顽拗性种子比较，银杏种子又具有耐低温、相对耐储藏的特性。由此认为银杏种子属于温带顽拗性种子。

参考文献

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3.2银杏种子脱水与硬化的关系

从前面的分析中可知，胚乳硬化是银杏种子发芽率降低

的主要原因之一。硬化种子虽然含有一定的水分，但却已经完全丧失了发芽能力。银杏种子脱水是一个量变的过程，而硬化却是一个质变的过程。在研究中发现，银杏种子内部一旦出现了部分硬化，就开始在极短的时间内迅速脱水死亡。目前，银杏种子硬化机理还不清楚。从本试验的研究结果来看，当含水量降低到10%时，绝大多数银杏种子已经硬化，而此时，细胞的显微和超微结构同新鲜银杏种子相比发生了很大变化，出现质壁分离、细胞壁和细胞膜降解、脂体破裂、线粒体分解等现象。脱水过程中细胞结构的改变可能是银杏种子脱水硬化的主要原因之一。

3.3银杏种子的休眠