肺炎链球菌耐药性及其耐药机制研究[1]

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World Notes on Antibiotics, 2011,Vol.32, No.1

肺炎链球菌耐药性及其耐药机制研究

佘婷婷， 徐元宏*

（安徽医科大学第一附属医院， 合肥 230022）

摘 要： 多重耐药肺炎链球菌全球瞩目。近年来，肺炎链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类及氟喹诺酮类抗生素的耐药率呈上升趋势，对其耐药基因的研究引起广泛关注，现就肺炎链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类及喹诺酮类抗生素耐药基因的研究进展进行综述。

关键词：肺炎链球菌； 耐药机制； 研究进展

中图分类号：R378.1　　　文献标识码：A　　　　文章编号：1001-8751(2011)01-0032-06

Update on the Study of Resistance and Mechanism of Streptococcus pneumoniae to Antimicrobial Agents

She Ting-ting, Xu Yuan-hong

（Department of clinical laboratory , the first affiliated hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022）

Abstract: Mutidrug-resistant(MDR) Streptococcus pneumoniae is a global concern. In recent years, resistance to β-lactam ,macrolide and fl uoroquinolone antibiotics has been increasingly observed in Streptococcus pneumoniae. Its resistant mechanism studies have aroused widespread public concern. This review describes update on the study of resistance mechanism of Streptococcus pneumoniae to antimicrobial agents.

Key words： Streptococcus pneumoniae； drug-resistant mechanism； update on the study

在过去的三十年中，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)作为社区感染首位病原菌，其耐药谱在全球范围内不断传播。70年代末耐青霉素肺炎链球菌在南非和西班牙已有报道，至90年代初期耐青霉素肺炎链球菌克隆株迅速传遍欧洲乃至全球。此外，大环内酯类及其它类别抗生素耐药株相继发现。当前全球15%~30%肺炎链球菌为多重耐药菌株(multiple drug resistance，MDR, 即对三类及以上抗生素耐药)，引起了世界瞩目。本文就肺炎链球菌流行病学，耐药特点和机制综述如下。1 流行病学特点

1.1 肺炎链球菌多重耐药全球流行

来自美国41个医学中心(2004-2005年)耐药监测

收稿日期：2010-10-22

作者简介：佘婷婷，女，在读硕士研究生，主要从事细菌耐药性研究。

数据显示：美国青霉素中介肺炎链球菌(penicillin-intermediate Streptococcus pneumoniae, PISP，MIC ≥ 0.1~1μg/mL)从1990-2000年的12.7%上升至2004-2005年的17.9%，青霉素耐药肺炎链球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae, PRSP，MIC ≥ 2μg/mL)从21.5%降至2004-2005年的14.6%；而多重耐药肺炎链球菌(multiple drug resistant Streptococcus pneumoniae, MDR-SP)无太多改变，2004-2005年仍高据20%[1]。有报道2001-2003年欧洲8个国家青霉素非敏感性肺炎链球菌（penicillin-nonsusceptiple Streptococcus pneumoniae, PNSP）达到24.6%，大环内酯类耐药肺炎链球菌(macrolide resistant Streptococcus pneumoniae，MRSP)达28%，提示

*,通讯作者：徐元宏，男，教授，研究生导师，研究方向：细菌耐药性研究。

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耐药菌株在欧洲迅速传播[2]。亚洲耐药菌检测合作组织（asian network for surveillance of resistant pathogens，ANSORP） 1998 -2001年[3]调查结果显示亚洲地区肺炎链球菌中 MRSP占 59.13 %。其中，韩国、台湾和香港的耐药率均在75 %以上，越南耐药率高达 88.13 %，并有继续增加的趋势。2005-2008年中国数据显示肺炎链球菌对红霉素的敏感率仅为9%[4]。

1.2 肺炎链球菌感染是儿童和老人的杀手病

肺炎链球菌主要是是健康儿童及成人上呼吸道感染后最常见的细菌之一，如果宿主防御机制发生改变，这些细菌就可能引起严重感染。流行病学调查结果显示2岁或2岁以下儿童患者是肺炎链球菌感染率最高的群体，老年人亦是罹患肺炎链球菌性疾病的高危人群。世界卫生组织(WHO)2007年数据提示每年肺炎链球菌引发的肺炎和脑膜炎造成80万至100万儿童致死，其中肺炎链球菌引起的死亡中超过90%是发生在发展中国家。耐青霉素肺炎链球菌引起感染流行的最重要的危险因素是年龄，其他的危险因素包括：集居儿和日托儿(可使PRSP增加10倍)、酗酒、居住过于拥挤、流浪汉、生活条件恶劣、长期住院者、免疫缺陷病患者、吸烟者和病毒性呼吸道感染等[5]。

1.3 肺炎链球菌感染疾病类型

肺炎链球菌感染可致非侵袭性疾病和侵袭性疾病(invasive pneumococcal disease，IPD)，前者为中耳炎、鼻窦炎和肺炎；后者包括脓胸、菌血症、脓毒血症、脑膜炎、骨髓炎、心包炎、心内膜炎、腹膜炎和化脓性关节炎等少见感染[5]。2 耐药特点2.1 多重耐药

1997年从南非发现不仅有耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)，而且还有对四环素、大环内酯类和氯霉素耐药的肺炎链球菌，此后世界各地均发现MDR菌株。加拿大自儿童患者分离到98.6%MDR肺炎链球菌对青霉素、红霉素和复方磺胺甲噁唑耐药[6] 。2004-2007年我国温州地区分离到339株肺炎链球菌，其中83.18%对青霉素不敏感，耐药率达56.34%，对红霉素、克林霉素和四环素的耐药率分别是98.23%、97.52%和84.36%，20%~30%对头孢噻肟和氯霉素耐药[7]。2006 年2月- 2007年2月北京、上海、广州和深圳等4家儿童医院279株S.pn对青霉素的不敏感率达

86. 0%、耐药率达23. 3%[8]。2.2 肺炎链球菌耐药呈现地区差异

研究表明不同国家或地区肺炎链球菌菌株的耐药性有差异，杨启文等[9]对全国10家医院院内与社区感染常见病原菌耐药性分析，发现在收集的353株肺炎链球菌中，不同医院分离的肺炎链球菌对青霉素的敏感性不尽相同，吉林省人民医院、北京协和医院和北京医院的分离菌株中PSSP所占比率>90%，而江苏省人民医院的分离株中PSSP所占比率仅22.7%。这种显著差异提示可能受地域条件克隆株的传播或是耐药株的选择变异的影响，也可能与抗生素使用习惯有关。

3 主要耐药机制

3.1 β-内酰胺类抗生素的耐药机制

3.1.1 青霉素结合蛋白(penicillin-binding protein，PBPs)

细菌PBP活性中心常是丝氨酸，β-内酰胺类抗生素正是通过对β-内酰胺环中的羧基和细菌相应的PBPs的丝氨酸的羟基共价结合成丝氨酸酯起杀菌作用。肺炎链球菌株对β-内酰胺类抗生素MIC值持续增加主要是由于青霉素结合蛋白的一系列变异所致。青霉素结合蛋白主要有两个作用：一是通过催化糖基转移酶而导致聚糖链的聚合；二是通过转肽作用使两个并列的肽键形成共价键。肺炎链球菌表达6种PBPs(PBPla、PBPlb、PBP2a、PBP2b、PBP2x、PBP3)，其中A类蛋白(PBPla、PBPlb、PBP2a)同时具有以上两个作用；B类蛋白(PBP2b，PBP2x)仅有转肽作用；PBP3具有D-D羧肽酶活性，而不具有以上两种酶活性[10]。PBP1a、PBP1b、PBP2x、PBP2a、PBP2b属高分子量（high-molecular-mass，hmm）PBPs， PBP3为低分子量（low-molecular-mass，lms）PBPs。

这些不同的PBPs和β-内酰胺类抗生素有不同的亲和力，PBPs的活性位点由3个含丝氨酸的保守氨基酸结构序列SXXK，SXN和KT(S)G构成。这些结构序列及其邻近序列的改变导致PBPs变异株的亲和力下降[11]，这些低亲和力的青霉素结合蛋白是由变异的pbps基因编码。

肺炎链球菌对青霉素类耐药的决定因子主要是pbp2x和pbp2b，它们突变仅仅造成对青霉素的低水平耐受，是pbpla突变后介导高水平青霉素耐药的基础，引起高水平青霉素耐药基因突变的一个先决条件。PBP2b保守结构序列的变异导致青

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霉素G耐药，PBP2x的变异引起头孢噻肟低水平耐药。绝大多数青霉素G高水平耐药（MIC值2~16μg/mL）与PBP1a、PBP2x及PBP2b变异相关。田素飞等[12]研究PNSP的pbp2b基因变异时发现在13株PNSP(MIC≥0.1 mg／L)中，均发生紧邻SSN的Thr445-Ala替换以及Glu475-Gly、Thr488-Ala／Ser的替换；而Glu332-Gly的替换也较常见，存在于12株PNSP(MIC≥0.25mg／L)中。在7株PRSP (MIC≥3 mg／L)中，均发生了紧邻KTG之后Ala618-Gly的替换，提示该位点的改变可能与PRSP对青霉素高水平耐药相关。

此外低亲和力的PBP1a是高水平耐药的基础，但同时需要PBP2b和或PBP2x变异的存在。由于超广谱的头孢菌素类抗生素不与PBP2b结合，其耐药仅与PBP2x和PBP1a有关。变异的PBPs包含一些高度歧异的来自缓症链球菌、口腔草绿色链球菌等的同源基因序列通过重组而成重组基因，可发生在不同位点呈多位点变异。这种镶嵌结构又称为镶嵌基因(mosaic gene)；镶嵌基因序列与PSSP差异可达25％。已证实pbp2x、pbp2b和pbpla具有许多镶嵌区域大小和序列关系不同的等位基因变体[13]。3.1.2 非青霉素结合蛋白因素

非PBPs 基因相关的肺炎链球菌耐药菌株都是感受态缺陷菌株。肺炎链球菌的感受态是由一个叫作感受态刺激因子(competence stimulating peptide，CSP) 的17 肽诱导形成的。CSP具有刺激感受态形成的活性，是comC基因的表达产物。在研究肺炎链球菌非PBPs基因变异的耐药机制时首先发现了ciaHR基因，其编码产物CiaH是位于细胞膜上组氨酸激酶受体。目前已知CiaRH二元信号系统的活化能阻止肺炎链球菌自然转化感受态的形成。最近的研究显示在实验室选择的PBP2x突变株需要一个功能性双向调节系统CiaRH，活化的Cia系统对多种细胞壁抑制剂介导的菌体融解具有高度抗性，因而对此类抗生素如环丝氨酸、杆菌肽、万古霉素耐药。反之无活性CiaRH突变株对早晚期的膜抑制剂高度敏感，且在普通培养基和失胆碱状态下不能维持静止生长期。PRSP的PBP2x突变株在无活性Cia系统存在时导致细菌生长速度减缓，早期自溶和细胞形态变异，可能提示 PBP2x 变异导致的β-内酰胺类抗生素耐药是在CiaRH 系统存在的基础上发生[14]。在没有PBPs基因变异的情况下，位于CiaRH上保守的组氨酸残

基中His226的T230-P及第二次跨膜区域上A203-V的突变独自介导了头孢噻肟的耐药[10,15]，从而佐证了非PBPs基因变异所致PRSP的耐药机制的存在。有研究发现在哌拉西林耐药菌株中存在另一个非PBPs的耐药基因cpoA(糖基转移酶)，cpoA编码一种糖基转移酶样蛋白，cpoA的变异体仍有一定的感受态诱导活性。ciaH、cpoA均可调节细菌脂质转运的水平，增加胞壁质的合成，其变异使肺炎链球菌在β-内酰胺类抗生素破坏了细胞壁肽聚糖合成的情况下仍能生存，从而导致耐药[16-17]。

此外，murM 基因在肺炎链球菌高水平青霉素耐药及头孢噻肟/头孢曲松耐药中的作用逐渐被证实。李绍英等[18]对55 株肺炎链球菌murM基因PCR 产物测序，16株murM基因发生显著变异(变异率≥3 %)，1 株青霉素MIC 3μg/ mL 、头孢曲松MIC 2μg/ mL的菌株，其murM基因变异率3. 4 %；15 株青霉素MIC ≥8μg/ mL 或头孢曲松MIC ≥2μg/ mL 的菌株，murM基因变异率达10 % ，显示呈嵌合式变异。由此可见肺炎链球菌murM基因变异与青霉素高度耐药(MIC ≥8μg/ mL) 及头孢曲松耐药(MIC ≥2μg/ mL) 有显著的相关性。Smith等[19]与Filipe等[20]研究提示虽然murM 基因变异与肺炎链球菌青霉素高水平耐药及头孢菌素耐药相关，但murM基因并不能完全调控肺炎链球菌耐药，同时必须发生pbp2x、2b、1a 变异，几种因素相互作用的基础上才能引起肺炎链球菌耐药的发生。

丁云芳等[ 21 ]报道从苏州地区儿童呼吸道感染肺炎链球菌中检测出TEM 型β-内酰胺酶基因，检出率达91. 3% (21 /23) 。提示肺炎链球菌可以通过获得含TEM基因的质粒而产生β-内酰胺酶，从而介导对青霉素耐药。谢国强等[22]发现TEM 阳性的菌株对β-内酰胺类药物中的青霉素耐药性较强，耐药率达到90 % (9/10) ; TEM 基因阴性的标本，其对β-内酰胺类药物的青霉素耐药性就比较弱，敏感率为90 % (9/1 0) , 中介率10 % (1/10)。提示肺炎链球菌获得性TEM 基因可能是其对β-内酰胺类药物耐药的原因之一。3.2 对大环内脂类耐药机制 3.2.1 erm基因介导核糖体靶位修饰

耐药肺炎链球菌可合成Erm酶( erm基因编码) ,将核糖体23SrRNA的2058位的腺嘌呤残基N26位二甲基化，从而使大环内酯类抗生素与核糖体作用位点的亲和力下降为1/104，可引起大环内酯类抗生素

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高水平耐药[23]。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药表型可分为M型和MLSB型。对十四元环（如红霉素、克林霉素）和十五元环（阿齐霉素）大环内酯类呈低水平耐药而对十六元环（麦迪霉素、螺旋霉素）大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B敏感的肺炎链球菌称为M 型。对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B 呈现交叉耐药的称为MLSB型。M型耐药仅携带mef(A)基因，MLSB型耐药不仅携带erm(B)基因，也同时携带erm(B)和mef(A)基因。MLSB型耐药分为结构性耐药(cMLSB)和诱导性耐药(iMLSB)。cMLSB耐药菌ermB mRNA有活性，经翻译合成结构性甲基化的核糖体而耐药。而iMLSB耐药菌，生成的ermB mRNA不具活性，仅表现为对大环内酯类抗生素低水平耐药。一旦有可产生诱导的大环内酯类抗生素存在，耐药基因erm被完全诱导，表现为结构型耐药，即对所有大环内酯类抗生素、林可霉素和链阳菌素B耐药[24]。

肺炎链球菌中ermB基因主要位于Tn1545 ( Tn1545-like)和Tn917 ( Tn917-like)等移动元件上, Tn917上ermB 基因呈诱导表达，Tn1545则由于衰减子序列的碱基缺失、复制或点突变导致甲基化酶的合成去阻遏而呈组成型表达[25] 。MLSB耐药的诱导表达受ermB结构基因上游调节区翻译衰减机制控制。3.2.2 mef基因介导的主动外排机制

大环内脂类外排基因（mef）编码的产物是一种外排泵，能以大环内脂类抗生素为底物，通过消耗能量将药物排出菌体外，从而降低细菌对药物的敏感性。1996年Sutcliffe首次发现大环内脂类外排系统，Clancy等[26]及Tait-Kamradt等[26]相继发现编码该系统的mefA，mefE和mefI基因（三者基因序列号分别为U70055、U83667和AJ971089），三者无论在核酸水平还是蛋白质水平均具有高度同源性，但在定位和基因序列的相关结构等方面存在不少差异。mefA定位于转座子Tn1207.1或Tn1207.3，可以在不同球菌属间水平传递；mefE基因定位于大环内酯外排基因集合体(macrolide efflux genetic assembly, mega)，亦可在球菌属间水平传递，并可整合到细菌Tn2009中；携带mefI的遗传成分长30 505 bp，左端是Tn5252和Tn916，右端为15 115 bp未命名的新基因，目前还未发现mefI基因具有传递性[27]。研究表明MefA外排泵的特异性底物是十四元环和十五元环大环内酯类，mef基因介导的耐药都发生在M型耐药细

菌，且一般是低水平耐药(1~32μg/mL)。临床上可以通过增加大环内脂类抗生素的剂量来克服此耐药。3.2.3 50S核糖体突变

即23S rRNA 突变或编码核糖体蛋白L4 、L22 的基因突变。50S核糖体中23SrRNA突变的位点主要有II区和IV区的752、2057、2058、2059、2609 和 2611位点，任一位点的突变都会引起大环内酯类抗生素与核糖体结合亲和力的改变，从而导致肺炎链球菌的耐药，突变的核糖体数量与耐药水平呈正相关[24]。

L4核糖体蛋白修饰使多肽链通道变窄，致使大环内酯类抗生素结合部位远离该通道而失效。L22 核糖体蛋白的改变为点突变，与L4 突变相反，它使多肽链通道变宽，以无效的方式结合大环内酯类抗生素[28]。核糖体蛋白L4、L22发生单个氨基酸残基变异时可导致耐药，而L4核糖体蛋白第59～90位氨基酸和核糖体蛋白L22的85～87位氨基酸以及C′羧基末端的变异是大环内酯耐药的重要区域。对50S核糖体的变异性研究显示，核糖体蛋白L4的G69T、T70P、G71S等3位氨基酸残基变异或者第67和68位氨基酸之间插入SQ 2个氨基酸残基，L22的3′羧基端插入了6个重复的氨基酸残基，即103RTAH IT108，以及23S rRNA的第2 058位的变异均与耐大环内酯类药物相关[29-31] 。

由核糖体突变导致耐药的肺炎链球菌约占临床耐药菌株的2 %以下，在欧洲、北美洲、澳大利亚和日本等地均发现了此类菌株[32-33]。国内目前尚无核糖体突变的报道。王强等[34]通过体外诱导获得肺炎链球菌耐药菌株，对比分析肺炎链球菌诱导耐药前后红霉素结合域的变异，发现诱导后标准菌株 MIC由0. 0312μg/mL增加到256μg/mL，而临床分离敏感株MIC均由0. 0312 μg/mL增加到32μg/mL。诱导前后测序结果对比显示标准菌株tigr4核糖体蛋白L4发生V32A变异，L22发生D35G变异，引起肺炎链球菌 tigr4对红霉素的高水平耐药；而临床分离敏感株核糖体蛋白L4发生Q67R、K68E变异引起肺炎链球菌 C1和C2对红霉素的中等水平耐药。空间构象分析L22的D35G及L4的Q67R、K68E变异导致其相应的表面空间构象发生明显改变。

世界各区域的研究表明不同地区间肺炎链球菌红霉素耐药主要机制存在一定的差别。在加拿大、瑞士、美国mefA介导的主动外排机制是其对大环内酯类耐药的主要机制，近年来同时含ermB和mefA的

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耐药菌株快速增长，2004年美国已达29.6%，且99%的阳性菌株为多重耐药[35]。虽然多数欧洲和亚洲国家以ermB介导的核糖体甲基化占优势，且亚洲国家ermB和mefA同时存在的比率高于欧洲及美国，如韩国占47.3%[36]。

我国张泓等[37]对上海地区2001-2004 年上呼吸道感染患儿鼻咽部分离的188 株MRSP进行耐药机制分析，ermB总检出率为91. 5 %(172/ 188) ，表明上海地区肺炎链球菌大环内酯耐药以ermB基因编码的cMLSB型中为主。值得注意的是mefE总检出率为38. 3 %，并且mefE检出率有逐年增加趋势，2001-2004 年检出率分别为18. 8 %、18. 9 %、36 . 7 %、57. 2 %。耐药表型为cMLSB的ermB ( + )、mef ( + ) 基因型组合从2001年的6. 3 %增加到2004 年42. 9 %。本研究未检出mef A基因，同时需要关注该地区大环内酯类外排基因mefE流行的趋势。

此外耐药基因的分布与患者的年龄密切相关。Hoban等[38]1999年至2000年从25个国家分离的肺炎链球菌显示儿童患者中肺炎链球菌菌对红霉素的耐药率明显高于成人患者，婴幼儿患者中分离ermB和mefA菌株较多。

3.3 对喹诺酮类药物的耐药机制

肺炎链球菌对氟喹诺酮类药物耐药主要由两个机制介导：一是DNA促旋酶及拓扑异构酶Ⅳ喹诺酮耐药决定区域（QRDR）染色体变异；二是外排泵作用增加[39]。DNA促旋酶由两个GyrA亚基、两个GyrB 亚基组成；拓谱异构酶Ⅳ由两个ParC(与GyrA同源) 和两个ParE (与GyrB同源) 组成，其中任何一个亚基突变都会引起耐药。细菌gyrA和（或）parC的一段核苷酸序列与喹诺酮类耐药密切相关，称为喹诺酮耐药决定区域(QRDR)。研究表明, GyrA的改变通常只发生在ParC或ParE突变之后。在肺炎链球菌中，低水平耐药与喹诺酮耐药决定区域(QRDR) 79或83 位的ParC或ParE位置的变异有关，而高水平耐药则需同时有GyrA或GyrB的改变[40]。

CROSS（ canadian respiratory organism susceptibility study）对来自加拿大各地25个医学中心自1998年到2005年所分离到的205株对环丙沙星耐药肺炎链球菌(MIC≥4μg/mL)研究显示最常见的突变位点是GyrA的Ser81-Phe和ParC的Ser79-Phe，均位于QRDR区，在GyrA、ParC、ParE都没有观察到QRDR区域外的突变。检测到21%耐药菌株有主动外排机

制存在，其中68%虽无QRDR变异却对利血平（一种外排泵抑制剂）敏感；另外检测到5株既无QRDR变异又对利血平耐药的菌株，推测可能存在未确定的外排泵抑制剂，gyrB突变或新的不明机制影响[41]。

近年来国内外的耐药菌监测结果显示PNSP的发生率在我国乃至全球都呈连年上升趋势，来自儿童患者分离到的肺炎链球菌中，PNSP的分离率更是居高不下。2009年中国9个城市12家教学医院的检测数据显示替考拉宁、万古霉素和利奈唑胺对肺炎链球菌仍有较好的活性，但总体活性有下降，因此有效及必要的措施如临床合理使用抗菌药物是控制耐药率上升的关键[4]。细菌耐药最基本的机制是耐药基因变异，耐药机制亦日趋复杂，严重的耐药现状已敲响了新世纪的警钟。对细菌耐药机制深入的研究为当前克服耐药，优化抗菌药物的临床应用，降低耐药选择性压力，强化医院感染控制措施，对阻止耐药菌快速传播具有重要意义。

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抗生素，但在治疗用药上，鲍曼不动杆菌面临更少的选择，应引起临床医生的高度重视。

在本研究中，引起ICU感染的另一较多的细菌为肠杆菌科中的大肠埃希菌和阴沟肠杆菌，分别占15.6%和13.2%，两种细菌除对亚胺培南敏感性高外，对其它抗菌药物均表现较高的耐药率。肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制是产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) [6]。本研究大肠埃希菌和阴沟肠杆菌ESBLs的检出率分别为54.5%（18/33）和39.3%（11/28），与文献报道[7-8]基本一致。产ESBLs大肠埃希菌除对亚胺培南、哌拉西林/三唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星敏感性较高外，对其它抗菌药物的耐药率在60%~100%之间，而产ESBLs阴沟肠杆菌除对亚胺培南耐药率为5.6%外，对其它抗菌药物的耐药在44%~100%之间。提示产ESBLs肠杆菌科细菌的检测对指导临床用药意义重大。

参 考 文 献

[1] Nation Committee for Clinical Laboratory Standards.

performance standards for antimicrobial susceptibility

（上接第37

页）

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