碱性成纤维细胞生长因子bFGF抗体研究进展
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３７９
文章编号：１００７—８７３８（２００９）０４—０３７９—０３
碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）抗体研究进展
刘李登综述向军俭４审阅（暨南大学抗体丁程研究中心，广东广州５１０６３２）
［关键词］碱性成纤维细胞生长因子；单克隆抗体；肿瘤；抗
体药物
【中图分类号］Ｑ８１３．２
［文献标识码］Ａ
碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｗｂｌ∞ｔ
ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，
ｂＦＧＦ）是由Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｚ等…于１９７４年在牛脑垂体中发现的，因对３１３细胞有强烈的促增殖和有丝分裂作用，且等电点为９．６而得名。此次发现展开了对成纤维细胞牛长因子的鉴定，纯化及测序等研究的序幕。在哺乳动物体内已发现的２３种ＦＧＦｓ中ｂＦＧＦ被命名为ＦＧＦ－２，与ａＦＧＦ同属ＦＧＦ．１亚家族。根据相对分子质量（Ｍ，）ｂＦＧＦ有１８
０００、２２
０００、
２２５００、２４０００、３４
０００等５种亚型。ｂＦＧＦ在促进血管新生、
细胞分裂及生长等方面有强烈的牛物活性。ｂＦＧＦ分布极其广泛，高表达于一些恶性肿瘤，其与肿瘤病理分级、分期呈正相关，近来研究表明它成为了一些肿瘤的标志物，一直是研究热点。２１。对此针埘ｂＦＧＦ的抗体研究引起了国内外学者极大的兴趣，ｂＦＧＦ抗体通过抑制ｂＦＧＦ活性及其下游信号传递，可产生明显的抗肿瘤效果。
ｂＦＧＦ单克隆抗体（ｍＡｂ）对于重组ｂＦＧＦ的表达、纯化和鉴定，体液中ｂＦＧＦ的定量检测和组织定位提供了有力的手段，为研究ｂＦＧＦ与肿瘤发生、发展机制的关系与开展对肿瘤的诊断提供了重要基础；ｔ：ｔ益备受重视的全人ｂＦＧＦ基因Ｔ程抗体具有抗体药物的研究开发前景。现就ｂＦＧＦ（Ｍ，１８０００）ｍＡｂ的制备、性质、应用、抑瘤机制、研究前景等进行综述。
１
ｂＦＧＦ
ｍＡｂ研制的状况
ｂＦＧＦ
ｍＡｂ研究始于１９８７年，Ｍａｓｓｏｇｌｉａ等旧Ｊ首次制备出
４株ｂＦＧＦｍＡｂ，随后日本Ｔａｋｅｄａ公司”。也制备了４株ｂＦＧＦｍＡｂ并申报了专利（专利号Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｌａｔｅｓ
Ｐａｔｅｎｔ５４７８７４０、
５９８１１９７），但无一抗体能抑制ｂＦＧＦ的促细胞牛长活性。１９８９年Ｒｅｉｌｌｙ等¨１制备出４株ｂＦＧＦｍＡｂ，其中ＤＥ６与ａＦＧＦ有交叉反应，ＤＧ２是第１种具体内外中和ｂＦＧＦ活性的ｍＡｂ。同年Ｍａｔｓｕｚａｋｉ等‘６Ｊ从１９２株杂交瘤细胞中筛选出２株分泌
ｂＦＧＦ
ｍＡｂ的细胞株，所分泌抗体分别被命名为ｂＦＭ．１和
ｂＦＭ－２，均能特异识别牛源性、人源性、鼠源性ｂＦＧＦ，与ａＦ．ＧＦ无交叉反应。体外实验发现上述两种ｍＡｂ均能抑制牛血管内皮细胞（ＢＣＥ）生长，在０．１—１０ｍｇ／Ｌ之间呈浓度依赖性，ｂＦＭ．１作用强于ｂＦＭ－２。１９９１年Ｈｏｒｉ等【川则首次报道中
收稿日期：２００８—０８—１８；接受日期：２００８～１０—０６
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）资助项目（２００６ＡＡ０２Ａ２４７）作者简介：刘李登（１９８４一），男，湖南岳阳人，硕士生
Ｔｅｌ：０２０—８５２２３２５９；Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｙｕｎ＿００７＠１６３．ｅｏｍ
４
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｘｉｊ＠ｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
万
方数据和性ｂＦＧＦｍＡｂ（３Ｈ３）能在特定的条件下抑制体内ｂＦＧＦ单独依赖型肿瘤的生长，不过所用的免疫原ｂＦＧＦ的第７０和８８位丝氨酸被半胱氨酸取代。１９９９年Ａｎｏｕｍａ等旧。制备了３株
ｂＦＧＦ
ｍＡｂ，发现２Ｇ１ｌ和ｌＥ６能体外中和ｂＦＧＦ活性，并分析
了肝素对ｍＡｂ生物活性的影响，认识到识别受体结合位点的ｍＡｂ具有体内外抑瘤活性。国内ｂＦＧＦｍＡｂ研究始于１９９８年，向军俭等一１制备的抗牛ｂＦＧＦｍＡｂ能体外中和ｂＦＧＦ促３１３细胞增殖的活性，２００８年又报道所制备的抗重组人ｂＦＧＦ的ｍＡｂ能诱导黑色素瘤细胞Ｂ１６凋亡¨…。
２ｂＦＧＦ
ｍＡｂ的识别表位
抗体对其抗原表位的识别关系到抗体中和活性。人源性和牛源性ｂＦＧＦ仅有２个氨基酸的差别，其抗原表位研究一直吸引着人们。对抗体的研究表明，抗体活性与其识别ｂＦＧＦ的表位非常相关。Ｍａｓｓｏｇｌｉａ等ｉ３Ｊ进行了抗体识别表位研究的首次尝试，他们制备的ｍＡｂ（ＭｃＡｂｓ４２）识别缺少１—１５肽段的ｂＦＧＦ分子；ＭｃＡｂｓ６、８、３８三种ｍＡｂ的识别表位则位于完全抗原氨基端的ｌＯ个残基内。Ｓｅｎｏ等’４Ｊ合成ｂＦＧＦ的Ｎ端ｌ－９肽，同时用大肠杆菌表达重组ｂＦＧＦ（１３—４０）肽段，通过肽段与ｂＦＧＦ分子的竞争实验，确定了Ｍａｂｌ２和７８识别位点位于１－９肽段内，Ｍａｂ５２和９８的识别位点位于１３－４０肽段内。上述ｍＡｂ都不能中和ｂＦＧＦ的体内外生物活性。Ｍａｔｓｕｚａｋｉ等№Ｊ
研究发现中和性单抗ｂＦＭ・１不识别Ｔｙｒ”ｂＦＧＦ（１—１５），Ｔ矿１
ｂＦＧＦ（３６－５０），研”２
ｂＦＧＦ（１３３．１４６）这几个线性片段，说明
ｂＦＭ．１识别ｂＦＧＦ空间表位，而无中和性的ｂＦＭ－２识别线性
表位。另外，Ａｎｏｕｍａ等¨１发现识别ｂＦＧＦ肝素结合表佗的
ｍＡｂ
２Ｇ１１体外能抑制肿瘤细胞生长但尤体内抗肿瘤作用；而
不与肝素竞争结合的ｍＡｂ１Ｅ６却表现出非常强的体内外抗肿瘤作用。他们研究还表明具有体内抗肿瘤作用的ｂＦＭ．１和
３Ｈ３
ｍＡｂ与ｂＦＧＦ的结合都不受肝素的影响。这些结果显示识
别ｂＦＧＦ受体结合表位的抗体能中和ｂＦＧＦ的生物学活性。目前，随着ｂＦＧＦ的线性序列、空间构象、受体（ＦＧＦＲ）以及结合肝素位点等的确定，中和性ｍＡｂ识别表位的研究可更进一步。
ｂＦＧＦ
ｍＡｂ的应用
ｂＦＧＦ的定量检测Ｓａｔｏ等¨川用ｂＦＧＦ多抗作为包被抗
体，利用ｂＦＧＦ与肝素特异结合的性质，以酶标肝素为榆测抗体，建立了第一个多抗－肝素ｂＦＧＦ夹心酶标检测法，最低检测量可到达３ｐｓ／１００斗Ｌ。１９９１年Ｗａｔａｎａｂｅ等‘１引建立了第一个实用性的ｂＦＧＦｍＡｂ夹心法，方法中应用Ｍａｂ５２和Ｍａｂ９８两种ｍＡｂ混合作为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的３Ｈ３的Ｆａｂ片段作为检测抗体，灵敏度叮达１０ｎｇ／Ｌ，对血清的检测
灵敏度町达３０形Ｌ。Ｍａｓａｙｕｋｉ等¨引改进了Ｗａｔａｎａｂｅ的方
法，通过改变酶反应底物使灵敏度提高了１０倍，对血清的检
３
３．１
３８０
１墅堕！鲤２二！！三墨绁堕蔓盆王鱼瘗堂苤查（垡！ｉ翌』堡！！！丛！！！塑婴！！！！）兰ＱＱ！：堑（业
测灵敏度达到３ｎｓ／Ｌ。Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ公司即在此基础上开发
出ｂＦＧＦ酶联检测试剂盒。Ｇａｂｒａ等。１４Ｊ又改进了Ｗａｔａｎａｂｅ的方法，使用抗牛ｂＦＧＦ的两种ｍＡｂ作为包被抗体，兔抗人ｂＦ－ＧＦ多抗作为检测抗体，使得灵敏度可达１ｐｇ／１００“Ｌ。这些方法的建立为ｂＦＧＦ微量检测提供了强有力的上具。国内向军俭等Ｈ５Ｉ建立的ｂＦＧＦ间接、竞争ＥＬＩＳＡ方法，灵敏度分别为ｌＯ和１．０ｐｇ／孔。刘士德等。１钊使用自制抗牛ｂＦＧＦｍＡｂ建立的ｂＦＧＦ双抗体夹心法最低检测量达２０肛ｇ／Ｌ，与商晶化试剂盒（３ｎＳ／Ｉ。）差距比较大。
３．２
ｂＦＧＦ的组织定位检测和分析Ｔａｋａｈａｓｈｉ等Ⅲ１使用鼠
源性ｍＡｂ（Ｍａｂ７８）对神经胶质瘤细胞和脑膜瘤分泌的ｂＦＧＦ进行免疫组化定位，发现ｂＦＧＦ大量分泌在这些肿瘤中。提示ｂＦＧＦ抗体ｎ，成为揭示ｂＦＧＦ与肿瘤相关性研究的有力工具之一，月前得到广泛应用。
３．３
ｂＦＧＦ生物学活性研究Ｅｒｎｓｔ等¨副在胃溃疡小鼠模型
上发现，使用ｂＦＧＩｒｍＡｂ能延缓溃疡的愈合，减少新牛血管的数毋，该发现进一步佐证了ｂＦＧＦ促ＩｌＩＬ管新生的功能。Ｔａｏ等旧１发现ｂＦＧＦｍＡｂ能体内外抑制小神经胶质细胞的分裂。这些研究证明ｒｂＦＧＦ的促有丝分裂、促ｍ管新生的生物学功能。提示ｂＦＧＦｍＡｂ在研究ｂＦＧＦ生物学活性方面具有潜在价值。
３．４抑制肿瘤生长的研究ｂＦＧＦ与肿瘤的密切相关性已有许多止而研究报道’２Ｊ，大量有关ｂＦＧＦ抗体与肿瘤的研究业已证实。早在１９８９年就已发现ｂＦＧＦｍＡｂ（ＤＧ２）能高度抑制体外培养的幼仓鼠肾脏内皮细胞对ｂＦＧＦ引起的血管新牛应答【７】。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等驯分别发现ｂＦＧＦｍＡｂ能体内外抑制神经胶质瘤的生长。Ｍｕｒａｉ等。２¨还发现ｂＦＧＦ中和性ｍＡｂ（３Ｈ３）能体内外诱导人脑胶质瘤细胞凋亡，为神经胶质瘤提供了一种有前途的治疗方法。但具体凋亡指数，凋亡机制有待进一步的研究。研究者发现ｂＦＧＦ和ＦＧＦＲ在胶质瘤细胞中高表达，而对照组的肺癌Ａ４３１细胞却无表达，大量研究显示与ｂＦＧＦ最为密切相关的是人脑神经胶质瘤。另外Ｏｇａｓａｗａｒａ等。２２１分析了肝癌细胞ｂＦＧＦ和ＦＧＦＲ的分泌量，还发现ｍＡｂ３Ｈ３能显著抑制肝癌细胞系及其体内移植瘤的生长。证明ｂＦＧＦ与肝癌的相关性。
随着研究的不断深入，学者们分析了不旧肿瘤细胞的ｂＦＧＦ、ＦＧＦＲ表达最，ｂＦＧＦ抗体对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用、实体瘤抑制作用等，并观察了多种抗体联合使用时抑制肿瘤的协同作用。Ｂｒｉｅｇｅｒ等”。研究了ｂＦＧＦ抗体和抗血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）抗体对鳞状上皮癌细胞对辐射抗性的作用，发现抗ｂＦＧＦ和ＶＥＧＦ抗体能有效减少放射处理后细胞集落的形成，加入ｂＦＧＦ抗体可使鳞状上皮癌细胞防辐射作用降低２０％。Ｒｏｆｓｔａｄ等Ⅲｏ研究了抗ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、白介素．８（ＩＬ．８）和血小板衍化内皮细胞牛长因子（ＰＤＧＦ）抗体对４株鼠移植黑色素瘤细胞系（Ａ－０７、Ｄ．１２、Ｒ—１８和Ｕ－２５）的生长抑制作用，白‘次报道了ｂＦＧＦ抗体和ＰＤＧＦ抗体能抑制移植黑色素瘤的生长，血管形成和转移。提示ｂＦＧＦ抗体与其他生长因子的抗体存在协同作用。国内向军俭等发现ｂＦＧＦｍＡｂ能体外抑制小鼠黑色素瘤Ｂ１６细胞的增殖，并诱导其凋亡，机制有待进一步的研究。林卫等口。发现ＳａｎｔａＣｒｕｚ商品
万
方数据化ｂＦＧＦｍＡｂ能明显抑制卵巢癌细胞的增殖，卵巢癌的牛长和血管新牛，并呈浓度依赖性。谢庆祥等ｍｌ通过建市裸鼠皮下移植膀胱癌动物模型进行研究，发现Ｓｉｇｍａ的ｂＦＧＦ
ｍＡｂ
治疗组皮下瘤体积和蕈量比对照组均显著减少，瘤组织中增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）指数和微血管密度（ＭＶＤ）也显著降低，表明ｂＦＧＦｍＡｂ对膀胱癌的生长具有明显抑制作用。其主要通过抑制膀胱癌细胞增殖和减少肿瘤血管形成而在荷瘤裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。
以上研究结果表明包括鳞状卜皮癌、人脑胶质瘤、软骨肉瘤、黑色素瘤、肾癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等癌细胞都对ｂＦＧＦ抗体敏感，其增殖分别受到不同程度的抑制，其中胶质瘤Ｕ８７和Ｕ２５１细胞系在ｂＦＧＦｍＡｂ单独作用下还能发牛凋亡，显尔出ｂＦＧＦ与肿瘤的密切相关性，而且ｂＦＧＦｍＡｂ有望成为肿瘤牛物治疗的新方法。但１日内目前尚未开发出具有显著体内抑瘤作用的ｂＦＧＦｍＡｂ，随着ｂＦＧＦ及其抗体研究的进一步深入，将为一些疾病的预防和治疗提供新的途径和方向。
４ｂＦＧＦ
ｍＡｂ抑制肿瘤生长的作用机制
各类研究显示，ｂＦＧＦｍＡｂ抑瘤作用机制卡要有两种：（１）直接抑制高分泌ｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ的肿瘤细胞生长，或诱导细胞凋亡口“；对于少量分泌ｂＦＧＦ的肿瘤细胞作用比较小心…。分泌ｍＡｂ（ｂＦＭ．１）的杂交瘸细胞注射到无胸腺的小鼠背部能致瘤，虽然小鼠血液巾抗体活性很高，但无抑制实体瘤生长的作用，间接表明ｍＡｂ对分泌ｂＦＧＦ的靶细胞起作用，而对ｂＦＧＦ分泌呈阴件的细胞无非特异细胞毒作用‘６Ｊ，本事也发现类似现象。表明ｍＡｂ对于受ｂＦＧＦ旁分泌和自分泌机制调控的肿瘤细胞才有效，对于ｂＦＧＦ内分泌型细胞无作用。（２）通过抑制ｂＦＧＦ诱导的血管新牛从而间接地抑制肿瘤的生长ｉ７Ｊ。ＶＥＧＦｍＡｂ发挥作用小是针对血管内皮细胞本身，而是中和ＶＥＧＦ与ｊ￡受体的结合，ｂＦＧＦ与ＶＥＧＦ同为膜分泌型生长因子，其机制是台类似于ＶＥＧＦｍＡｂ？目前人们对ｂＦＧＦ的信号通路比较清楚，那么ｂＦＧＦ中和性ｍＡｂ抑瘤的分子机制究竟是阻断ｂＦＧＦ与其受体的结合起阻断和中和作用，是被内化入细胞Ａ接起杀伤作用，还是影响ｒＦＧＦＲ受体酪氨酸激酶的活性引起下游信号通路发牛改变，这些都需进一步的研究。其中町对ｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ卜．游接头蛋白（Ｓｈｂ）和纤维细胞生长凶子受体底物２（ＦＲＳ２），以及细胞外调节蛋门激酶（ＥＲＫ）和促分裂素原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）的磷酸化水平的变化情况进行研究。
５展望
二十多年来ｂＦＧＦ抗体经历了多克隆抗体、ｍＡｂ、ｂＦＧＦ片段抗体、人源化抗体的发展阶段。目前ｂＦＧＦｍＡｂ已成功商品化，中和性ｍＡｂ有ＦＢ８（Ｓｉｇｍａ公司），ｂＦＭ一１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）和３Ｈ３（Ｃａｉｂｉｏｃｈｅｍ公司）。Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司生产的许多抗体，是使用ｂＦＧＦ片段作为免疫原而制备的，同样具有广泛的应用功能。但是相比２００４年被ＦＤＡ批准上市的ＶＥＧＦ
ｍＡｂ
Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ来说，目前的商品化ｂＦＧＦｍＡｂ却局限于实
验窒研究，其临床研究仍未见报道。原因可能有：（１）ｂＦＧＦ只在某些恶性肿瘤中高表达、与某些肿瘤呈高相关性。因此
！墅塑！塑！二盟！墨堡丝皇坌王鱼壅堂苤壶（堡坠翌』堡！！！塑旦！！！磐！坠！１２至Ｑ塑：至主（垒２
３８１
针对ｂＦＧＦ高分泌型肿瘤时ｂＦＧＦｍＡｂ的治疗才有效¨Ｊ，提示中和性抗体抑制血管新生和肿瘤牛长的效果会凶肿瘤的不同而出现较大差异，且肿瘤细胞需同时高表达ｂＦＧＦ及其受体，ｍＡｂ才会有抑瘤作用；（２）一些研究表明ｂＦＧＦｍＡｂ在阻断ｂＦＧＦ信号通路时，可致ＶＥＧＦ上调；另外ｂＦＧＦ与ＰＤＧＦ－ＢＢ也有协同作用，阻断ｂＦＧＦ的信号通路时可激活ＰＤＧＦ．ＢＢ信号通路，从而不能抑制肿瘤牛长。当然肿瘤受ｂＦＧＦ与其他多种细胞生长因子的网络调节较为复杂，它们促肿瘤生长作用的主次关系是ｂＦＧＦｍＡｂ成为抗肿瘤药物的关键。
我们认为ｂＦＧＦｍＡｂ的研究在以下方面仍值得完善：（１）ｍＡｂ识别表位的研究。最近报道的识别ＦＧＦ・１９和ＦＧＦ－８ｂ空间表位的ｍＡｂ具有中和性与抗肿瘤功能，该研究为ｂＦＧＦｍＡｂ的识别表位研究提供了新的方向；（２）ｍＡｂ引起的细胞信号通路变化，多种抗膜分泌型因子的ｍＡｂ均能诱导细胞凋亡口“，其机制的深入研究叮能会给ｂＦＧＦｍＡｂ的抗肿瘤研究带来新的思路；（３）高亲和力ｂＦＧＦｍＡｂ的制备及人源化研究拉“，该类研究可有效减少ＨＡＭＡ反应因而显得非常重要，目前本室正在开展此工作。
总之ｂＦＧＦｍＡｂ能在体内外有效地抑制自分泌或旁分泌ｂＦＧＦ依赖性肿瘤的生长，具有肿瘤生物治疗药物的开发前景，进一步研究其抑瘤机制，以及其与多种肿瘤相关因子抗体的协同抑瘤作用，是ｂＦＧＦｍＡｂ用于肿瘤治疗的研究策略之一。
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