真菌多糖的化学结构

真菌多糖的化学结构可分为一级、二级、三级、四级结构。真菌多糖的一级结构主链主要有两种：一种是葡聚糖，以β-1，3糖苷键连接为主，兼有少量β-1，4或β-1，6糖苷键，如自然界中的茯苓多糖、云芝多糖等的分子结构；另一种是甘露聚糖，主要由α-糖苷键连接，如：冬虫夏草多糖是α-1，2糖苷键连接，银耳多糖和黑木耳多糖是α-1，3糖苷键连接。真菌多糖的二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合形成的各种聚合体，只与分子主链的构象有关，不涉及侧链的空间排布形式。真菌多糖的三级结构是指由多糖中糖残基中的官能团间通过非共价作用而导致的有序、规则而粗大的空间构象。四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体。

多糖的结构单位可以是直链，也可以有支链：直链一般以α-1，4-和β-1，4-苷键连接，分支链中常以α-1，6-苷键连接。

1 真菌多糖结构研究方法的进展

经过分离纯化的多糖在测定结构前需检查其纯度并确定相对分子质量。目前检查其纯度和确定相对分子质量最常用的方法是高效凝胶液相色谱法（HPGPC ），即高效体积排阻色谱法（HPSEC ），采用示差折射检测仪（RI ）直接检测，如为对称的单峰，说明其均一性良好。需要注意的是，有些样品在水溶液中测定会出现不止一个峰，有可能是聚合所致，此时可换用二甲亚砜（DMSO ）作溶剂，会变成一个峰。体积排阻色谱一示差折射检测仪（SEC-RI ）测定多糖的相对分子质量，需用一系列已知相对分子质量的标准多糖做标准曲线，通过测定样品的洗脱体积，与标准曲线对比，得到相应的相对分子质量。目前最先进的检测仪是小角激光散射仪（LLS ），可以不用标准品而方便地测定多糖的相对分子质量及其分布，还可得到分子链的构象信息。近些年来，体积排阻色谱-小角激光散射仪（SEC-LLS ）结合诸如紫外（UV ）、折光指数（DRI ）检测器对于高度分散的聚合体系统的特征分析，被证明是一种非常好的有效的方法。

组成多糖的单糖品种繁多，单糖的连接顺序、连接位置的不同以及可能有的侧链使多糖结构更具复杂性，其结构鉴定也更困难。目前常用的多糖结构分析方法主要分为3大类，即化学分析法、物理分析法和生物学分析法。包括酸水解、高碘酸氧化、Smith 降解、甲基化分析等在内的化学分析法仍然是多糖结构分析常用的方法。物理方法主要包括紫外（UV ）、红外（IR ）、质谱（MS ）和核磁共振（NMR ）。生物学方法主要是酶学方法，即利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片断，通过分析寡糖片断的结构来推测多糖的结构。

近些年来，各种软电离技术如快速原子轰击电离质谱（FAB-MS ）、液态二次离子质谱（LSI-MS ）、电喷雾质谱（ESI- MS）、基质辅助激光解吸电离质谱（M ALDI-MS ）的出现使糖的分析有了很大的进展，可获得提供相对分子质量信息的分子离子峰和提供化合物结构信息的碎片峰。

二维NMR 技术（2D-NMR ）如COSY 、TOCSY 、ROESY 、 HMQC、HMBC 等的迅猛发展，为多糖的结构解析提供了有力的工具。由于多糖中大部分氢化学环境相似，氢信号相互重叠严重，造成解析的困难。H ，H-COSY 谱揭示质子与质子间的自旋偶合关系，包括质子间孪生、邻位和远程偶合相关。通过糖上质子间的偶合关系，可从容易辨认的质子（如异头质子或甲基质子）开始，寻找糖上其他碳位的质子。Laroeque 等从Bordetella avium中得到一个0-多糖，采用二维CO- SY，使每

个质子的信号得到确认。TOCSY 是分子内氢偶合链的接力相干信息，如果偶合常数较大，其信息会象接力赛一样沿着碳链传递，中止于偶合常数小的部位，不同的单糖残基有不同的偶合特征，根据TOCSY 的特征可以判断糖残基的类型。如P roteus mirabilis 0 40的脂多糖经缓和酸水解后，分离到一个0-多糖，建立在偶合常数J 2,3、J 3,4、J 4,5的基础上，从其COSY 和TOCSY 谱中鉴定了1个半乳糖和2个乙酞氨基葡萄糖的自旋系统，并从偶合常数J 1,2判断出单糖的构型。

NOESY与ROESY 谱提供了糖环质子的残基内的和残基间的NOE 相关，糖残基内的NOE 相关不仅能够提供有关糖残基相对立体化学的信息，并且可为归属残基内采用CO- SY和TOCSY 谱未能归属的质子信号提供有用的信息，而残基间的NO E 相关可为测定糖残基的连接顺序和糖基化位点提供关键性的信息。从Bordete lla cerium中得到的0-多糖，单糖残基内（H 2, H4）和（H 3，H 5）强的NOE 效应证实了葡萄糖残基的存在，（H 1,H 3）和（H 1，H 5）强的NOE 效应表明，其为β-构型，而（H 1，H 4）NOE 相关峰的出现为1，4-糖苷键的特征。Mondal 等从食用蘑菇Termitomyces eurhizus的子实体中得到2个多糖PS-Ⅰ和PS-Ⅱ，通过NO ESY 实验确定了单糖残基间的连接顺序。Providencia stuartii 044中得到的 O-多糖，其ROESY 揭示了各个残基间的相关，α-Fuc H-1，α- Glc H-3在δ5. 27/378；α-Glc H-1，α-Qui H-4在δ5.03/326； α-Qui H-1，α-G1cNAc H-3在δ5.01/388；α-G1cNAc H-1，α- Ga1NAc H4在84.86/4.02；α-GaINAC H-1，α-Fuc H-3在 δ5.24/4.05；β-G1cA H-1，α-Fuc H-4在δ4.55/411，证实了重复单元中单糖残基间的连接顺序和连接位置。Lemercini- er等主要利用2D-NMR （DQFCOSY,TOCSY, ROESY, HSQC）确定了从Streptococcus pneumoniae中得到的一个复杂多糖的结构。从Proteus vulgaris 045中得到0-多糖，通过 HSQC与HMBC 实验，结合其他二维谱，确认了组成多糖的各个单糖的自旋系统。

2 近年来研究报道的真菌多糖的结构

到目前为止，从真菌里分离出来的多糖有几十种，分聚糖、杂多糖、蛋白糖和肽糖，糖的种类与真菌种属间无明显的相关性。由于研究糖类方法的复杂性与技术的局限性，目前分离得到的多糖纯品实际上为糖链长短不一的混合物，结构分析多局限于一级结构，高级结构的研究比较少。

2.1 聚糖

近年来研究报道的真菌聚糖中，以葡聚糖居多。Bao 等从Ganoderma lucidum 孢子中分得一葡聚糖，重均相对分子质量（M w ）为1.0×104，主链为(1→3)-β-D-葡聚糖，在主链的C-6位有一个、两个和几个葡萄糖取代，通过甲基化分析、Smith 降解、1D 和2D-NMR 、ESI-MS 确定了其复杂的结构。Mondal 等从食用蘑菇Termitomyces eurhizus的子实体中得到2个多糖PS-Ⅰ和PS-Ⅱ，均为α-葡聚糖，其中PS-Ⅰ 结构主链由（1→6）-α-D-葡萄糖和（1→3）-α-D-葡萄糖组成，比例为2.5:1，无分枝；PS-Ⅱ则为（1-.6）-α-D-葡聚糖。Wu 等从C ordyceps sinensis中得到的葡聚糖，主链为(1→4)- α-D-葡萄糖，并有微量的（1→6）-α-D-葡萄糖侧链。葡聚糖 A62-2N,来源于食用真菌巴西蘑菇Agari cus blazei,主链为 (1→6)-β-D-葡聚糖，每3个葡萄糖残基中在C-3位有1个侧链取代，侧链包括1个末端的葡萄糖和1个C-3位取代的α- D-葡萄糖残基。来源于真菌Botryosphaeria sp细胞外液的胞外多糖botryosphaeran ，主链为（1→3）-β-D-葡聚糖，每5个葡萄糖残基中在C-3位有1个侧链取代，侧链由单个的（1→ 6）-β连接的葡萄糖基和(1→6)-β连接的龙胆二糖残基组成。从

Phytophthora parasitica中得到的几个胞外葡聚糖， Mw 从1.0×104～5.0×106不等，均有一个（1→3）-β-D-葡聚糖主链，分别有一个、两个、几个糖链通过（1→6）连接取代。海产丝状真菌Phoma herbarum多糖YCP 为α-（1→4）连接的葡萄糖主链，侧链通过(1→6) 连接取代。Cordyceps sinensis 多糖为(1→3）-β-D-葡聚糖。张丽萍等从金顶侧耳（Pleu- rotus citrinopileatus)子实体中分离的多糖Pc-4，M w 为1.89× 104，可能的结构是主链为α-(1→3) 连接的葡聚糖，支链为 β-（1→6）连接的葡聚糖。黑石耳（Dermatocarpon miniatum）子实体多糖为α-（1→4）、（1→6）连接的葡聚糖。以上提及的葡聚糖多数具有免疫调节或抗肿瘤活性，目前在临床上广泛应用的香菇多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖、小菌核葡聚糖均为（1→3）-β-D-葡聚糖。

2.2 杂多糖

从Hericium erinaceus子实体中分离到一个新的杂多糖HEP-1，M w 为1.8

4×10，由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为1.19:3.81:1.00。HEP-1有一个（1→6）连接的α- D-半乳糖骨架，某些单元的O-2位上为(1→6)-β-D-葡萄寡糖单元和少量的鼠李糖残基；鼠李葡萄糖侧链在骨架上分布不均一，其一端有高分枝，其他末端几乎无分枝；大多数葡萄糖残基侧链有0-2位取代的鼠李糖作为末端，侧链的平均聚合度是3.7。Gao 等从Tremella fuciformis中分得4种酸性杂多糖T 3a ～T 3d ，Mw 分别为55.0×104、42.0×104、5.5× 104、4.8×104，糖链分析表明，它们均有一个甘露糖骨架，约一半的甘露糖在0-2、0-4或0-6上有葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、木糖或葡萄糖醛酸基团取代。PL-1和PL4是来源于Ga- noderma lucidum的2个杂多糖，经结构分析PL-1主链为（1→4）连接的α-D-葡萄糖残基和(1→6) 连接的尽D-半乳糖残基，在葡萄糖0-6位和半乳糖的0-2位有分枝，分枝由末端葡萄糖、（1→6）连接的葡萄糖残基和末端鼠李糖组成；PL- 4由（1→3）、（1→4）、（1→6）连接的β-D-葡萄糖残基和（1 →6）连接的β-D-半乳糖残基组成。灰树花（Grifola frondo- sa）菌丝体多糖G.F.-1的M w 为1.23×106，由木糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.9:

1.4:4.7，其一级结构是由以β- (1→3) 、β-(1→6) 糖苷键为主，分枝点大部分发生在主链糖基C-6位的β-D-葡聚糖构成。从Laetiporus sulphureus中得到的1个杂多糖，其中部分的0-2位有3-0-D-甘露糖-α-L- 岩藻糖、α-D-甘露糖、α-L-岩藻糖取代。从蛹虫草（Cordyceps minlitaris）、红栓菌（Pronop orus cinnbarius）、凤尾侧耳（Pleurotus ostreatus）等真菌里也分离得到了杂多糖。

2.3 蛋白糖和肽糖

Kim等从Phellinus linteas中得到一个酸性蛋白杂多糖，M w 为15.0×106，此酸性多糖包含72.2%的多糖和 22.3％的蛋白质，多糖部分由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖组成，蛋白质部分由门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸组成；1R 光谱860，910 cm-1分别为α-和β- 多糖的特征，NMR 光谱表明，此酸性蛋白杂多糖为一混有α- 和尽连接、具有（1→6）分枝的（1→3）多糖。蛋白多糖和肽多糖也有从蛹虫草菌（Cordyceps millitaris）和赤灵芝（T rametes robiniophila）中分离得到。

3 真菌多糖的构象研究

多糖的化学结构是其生物活性的基础，而探讨结构与功能的关系，构象尤为重要。

在水溶液中多糖糖链间的相互缔合是比较普遍的，这是由于糖链上存在着许多自由羟基，易形成氢键。例如茯苓葡聚糖的羟乙基和羟丙基衍生物在水溶液里用SEC-LLS 法测得M w 分别为76.8×104和224.3×104，而在二甲亚砜溶剂里测得

44它们的实际MM w 为20.1×10和19.1×10，由于样品在水溶液中缔合，造成相对

分子质量测定结果偏大很多，在二甲亚砜中则不存在氢键缔合的问题。

适宜的离子基团的引进可引起糖链的聚合，从而在水溶液里形成与原来多糖不同的构象。Wang 等从茯苓（Poria cocos）里分离的水不溶性（1→3)-β-D-葡聚糖，无抗肿瘤活性，将其分别进行硫酸化、羧甲基化、甲基化、羟乙基化、羟丙基化得到三个水溶性衍生物。硫酸化、羟甲基化衍生物在水溶液里呈相对扩展的链状，链刚性较大，表现出明显的抗肿瘤活性；羟乙基化、羟丙基化衍生物由于在水溶液里的聚合，导致一个偏高的相对分子质量，抗肿瘤活性较低。这些衍生物的抗肿瘤活性随着水溶性的增大而增加。

香菇多糖、裂褶菌多糖、小菌核葡聚糖均为(1→3)-β-D- 葡聚糖，均具有三股螺旋链，有很高的刚性，在水溶液里趋向形成有序的结构。据报道它们的生物活性与其(1→3）-β- D-葡聚糖主链的三股螺旋链结构紧密相关。这类多糖可与刚果红形成络合物，在0～0.5 mol·L -1氢氧化钠溶液内，表现为最大吸收波长的特征变化。但（1→3）-β-D-葡聚糖主干链的长短、主链的取代度、支链的长短等均可影响三股螺旋链的稳定性。例如灵芝孢子葡聚糖SP 及降解葡聚糖SP - 1，刚果红实验证明，降解葡聚糖SP-1较原始葡聚糖SP 有着与香菇多糖相似的三股螺旋链，在水溶液里有较规则有序的构象，降解葡聚糖SP-1的免疫活性明显强于原始葡聚糖 SP。从斜顶菌中分出三种多糖，结构相似，但相对分子质量大小不同，它们与刚果红形成的络合物曲线不同，主干长、相对分子质量大者其三股螺旋链稳定，表明主链的取代度和侧链的长度对于真菌中（1→3）-β-D -葡聚糖在水溶液中的构象和生物活性有着重要的影响。

SEC-LLS可以不用标准品方便的测定多糖的相对分子质量、相对分子质量分布及分子链的构象。用M w 和回转半径（＜s 2＞z 1/2）数据，可以在色谱图上得到M

21/2 的分布情况。通过描述M w 和＜s 2＞z 1/2的依赖性幂法则（＜s 2＞z 1/2 w 或＜s ＞z

αM w α），由α值可获得关于聚合体构象的有用信息。一般α值0.3表明聚合体为球状，0.5为可曲伸的螺线形，0.5～1为杆状链。如从灵芝（Ganoderma lucidum ）里提取的一个水溶性蛋白多糖，体积排阻色谱中出现2个峰成分I 和成

21/2分Ⅱ，根据M w 和＜s ＞z 的关系，成分Ⅰ较成分Ⅱ有一个较紧凑的螺线构象。

电子显微镜则能直观的看到多糖链的状态。如从Cryp- toporus volvatus子实体中得到的水溶性葡聚糖，电子显微镜下观察该葡聚糖及其声处理样品均为线形象蠕虫状的链，并由显微镜下得到的外形长度和相对分子质量计算长均相对分子质量（M L ）分别为1 750和1 780，这些数据与多糖为三股链结构相一致。B otrytis cinerea胞外多糖cinerean,M w 为 109～1010，电子显微镜观察为环状循环但好像没有尽头的纤维，直径大约1.5 nm，M w 约（172000±3 000）的声处理样品则呈杆状分布，大部分长为45 nm，长均相对分子质量（M L ） 1 830，提示声处理样品为一四元结构。这样的结构将能解释杆状多糖的刚性和劲度，而充足长的刚性分子在水溶液里即使没有分子间的相互引力也趋向于形成有序的结构。导致多糖刚性的四元结构对于其生理活性的发挥也是至关重要的。

4 小结

多糖是真菌中一类重要的生物活性成分，生境、培养条件及提取分离技术不同都会造成多糖结构上的差异而影响活性，因此多糖的结构研究是深入了解多糖、改造多糖的基础。随着各种分析技术的高速发展，目前已确定了多种真菌多糖的一级结构，并对其构象有所研究，探讨了结构与活性之间的关系。继续进行深入的结构研究将会大大推动真菌多糖的开发和利用。