鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡
第24卷第6期2000年11月水生生物学报Vol. 24, N o. 6Nov . , 2000
鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡
屈三甫1 张小榕1 郑从义1 胡国斌1
艾桃山2 丁桂珍2 喻运珍2 刘 颖2
(1武汉大学生命科学学院, 武汉 430072; 2武汉市水产科学研究所, 武汉 430065)
摘要:采用荧光显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪分析等技术研究鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞(CIK) 凋亡。结果显示, 鱼呼肠孤病毒感染CIK 细胞后, 光镜下可见空斑形成; 荧光染色观察到细胞凋亡碎裂核; 且电镜下呈现细胞核裂解, 核周裂隙增大, 细胞膜内陷并出泡形成凋亡小体现象; 琼脂糖凝胶电泳出现180 200bp 整数倍的DN A 梯形带; 流式细胞仪检测到典型的细胞凋亡峰, 在病毒感染48h, 细胞凋亡百分率达15%。上述结果显示, 鱼呼肠孤病毒诱导CIK 细胞凋亡是其致细胞病变死亡的重要表现形式之一。
关键词:鱼呼肠孤病毒; 草鱼肾细胞; 细胞凋亡
中图分类号:S941. 41+2 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2000) 06-0616-06
草鱼出血病(Hemorrhage Disease of Grass carp) 是草鱼幼鱼阶段的主要感染性疾病, 该病死亡率高, 造成渔业生产上的巨大损失。现已证实, 鱼呼肠孤病毒(Fish Reovirus, FRV) 是草鱼出血病的病原体。有关鱼呼肠孤病毒特征, 受染宿主的病理学变化及草鱼出血病的防治等诸多方面已进行了深入研究。但是鱼呼肠孤病毒致细胞病变死亡机理却一直悬而未决。本文报道了鱼呼肠孤病毒感染草鱼肾细胞并诱导细胞凋亡(Apoptosis)的研究结果, 为阐明鱼呼肠孤病毒致宿主细胞病变死亡机理提供新的实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 鱼呼肠孤病毒由武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏并提供, 草鱼肾细胞系(CIK) 由中国科学院武汉病毒研究所方勤研究员惠赠, DMEM /F12培养基购于美国Sigma 公司, 胎牛血清(FCS) 系杭州四季青生物工程材料研究所产品。
1. 2 细胞培养 CIK 细胞用DM EM /F12+10%FCS 培养基常规传代培养。取对数生长期细胞3 105个接种T -25培养瓶或直径6cm 平皿, 28 , 5%CO 2培养箱中贴壁生长24h 。
1. 3 病毒感染 鱼呼肠孤病毒经无血清培养基稀释, 取105TCID 50病毒量1mL 收稿日期:1999-04-19; 修订日期:1999-09-15
基金项目:国家教委重点基金资助课题(94-170)
作者简介:屈三甫(1966 ) , 男, 湖北省武汉市人, 工程师, 从事细胞生物学研究
通讯作者:郑从义[1 3]
6期屈三甫等:鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡 617接种CIK 细胞, 28 感染1h, 去病毒液, 加含5%FCS 的维持液5m L, 并设正常对照组, 置28 , 5%CO 2培养箱培养, 于6h, 12h, 24h, 48h 用倒置相差显微镜观察细胞形态并取样作细胞凋亡检测。
1. 4 Hoechst 33258荧光染色观察[4] CIK 细胞于平皿内盖玻片贴壁生长, 经病毒感染, 适时取出固定、染色, 于Olympus 荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化。
1. 5 电子显微镜观察[5] 受染细胞经固定、脱水、包埋、超薄切片、染色, 于H-300透射电镜下观察结果并照相。
1. 6 DNA 电泳分析 按参考文献[6]的方法提取CIK 细胞DNA, 2%琼脂糖凝胶电泳, U V 灯下呈相并在SX-300生物影像分析仪上计算DNA 分子量。
1. 7 流式细胞仪(FCM) 检测 参考文献[7]的方法略加改进, 按如下程序进行:常规收集细胞, PBS 洗2次, 加75%的冷乙醇2mL 固定, 置-20 冰箱12h 以上, 离心去固定液, 加入RNase 200 L(1mg/mL) 作用30min 后, 再加入800 L PI 染色液(100 g/mL PI, Sig ma; 1. 0%Triton-X100, Servea; 0. 9%NaCl) 4 避光染色30m in, 进行FCM (FACS, 美国B. D. 公司) 检测和分析。
2 结果
2. 1 受染CIK 细胞的形态学变化
倒置相差显微镜观察发现, 病毒感染CIK 12h, 细胞单层局部产生病变, 有极少数空洞出现; 24h 细胞病变明显, 空洞增大, 细胞呈网状连接, 并有部分细胞脱落; 48h 后, 细胞病变严重, 网状连接减少, 大片细胞脱落。而正常对照组细胞则生长良好, 形成致密单层(图版 :1, 2) 。
荧光染色观察结果显示, 病毒感染CIK 12h, 少数细胞核溢缩、裂解并呈哑铃状等形态; 感染24h 后, 细胞核凝聚成几块; 而感染48h 后凋亡细胞核碎裂呈分散状态, 但仍聚集在一起; 这些都表现为典型的细胞凋亡核形态特征(图1)
。
图1 CIK 细胞的荧光染色
Fig. 1 Hoechs t 33258staining of CIK cells.
1. Normal CIK cell nuclei ( 200) ; 2. C IK cells infected w ith
FRV showing breakdown and condensati on of nuclei at 24h ( 200) .
电镜观察结果进一步证实, 鱼呼肠孤病毒具有诱导CIK 细胞凋亡的能力。CIK 细胞受染初期(12h) , 凋亡细胞核固缩、裂解并向外突出, 核周裂隙增大, 并可见细胞膜内陷突
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出形成小泡; 随着感染时间延长(24h) , 核膜
不完整或消失, 细胞剧烈 出泡 , 以出芽方
式形成凋亡小体; 感染后期(48h) , 凋亡细胞
完全裂解为凋亡小体或胞质空泡增多的残
留细胞母体。并且在受感染细胞质中, 明显
可见病毒粒子的存在(图版 :3 6) 。
2. 2 鱼呼肠孤病毒诱导CIK 细胞凋亡的
DNA 梯形带特征
病毒感染6h, 12h, 24h, 48h 后提取CIK
细胞的总DNA, 琼脂糖凝胶电泳。结果显
示, 病毒感染12h, CIK 细胞DNA 开始出现
约180 200bp 整数倍的DNA 梯形带,
DNA 梯形带的出现是细胞凋亡的重要生化
图2 鱼呼肠孤病毒诱导CIK 细胞
凋亡DNA 电泳图谱
Fig. 2 DNA ladders from CIK cells i nduced
by FRV at different time poi nt.
At time point ranging from 6h to 48h after infection w i th
FRV, DNA ladders could be fi rst detected at 12h post-in
fection. M , PCR marker, from 237to 1543bp si z e, lan e 1
show ed mock-infected, lanes 2to 5marked 6h, 12h, 24h,
48h after FRV infection respectively. 特征(图2) 。2. 3 鱼呼肠孤病毒诱导CIK 细胞凋亡的流式细胞仪分析流式细胞仪分析结果显示, 病毒感染CIK 细胞后, CIK 细胞DNA 直方图出现凋亡细胞特异的亚G1峰(又称Ap 峰) (图3) , 在病毒感染24h 、48h, 细胞凋亡率分别为
8%、15%
。
图3 鱼呼肠孤病毒诱导CIK 细胞凋亡的DNA 直方图
Fig. 3 Time course of sub-G1peak from CIK cel ls induced with FRV
The peak pattern, includi ng sub-G1peak, from CIK cells i n duced w ith FRV was detected at 24h (2) ,
48h(3) post-infection and normal CIK cells, w hich w ere mock-infected, showed no sub-G1peak (1) .
3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡(Prog rammed Cell Death, PCD) 是不同于细胞坏死(Necrosis) 的一种细胞死亡方式, 它是细胞接收死亡信号产生的一种受其自身基因调控的主动自杀过程。细胞凋亡与细胞坏死在形态特征及生化性质上有明显差异; 凋亡细胞在
6期屈三甫等:鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡 619形态学上表现为胞浆浓缩, 核固缩、裂解, 质膜内陷将细胞分为有膜包裹但内含物不外泄的凋亡小体; 生化特征为凝胶电泳呈现DNA 梯状带[8 10]。草鱼肾细胞被鱼呼肠孤病毒感染后, 也呈现细胞凋亡的形态学变化(图1) 和典型生化特征(图2) , 尤其是流式细胞仪检测分析出现细胞凋亡峰(图3) 进一步佐证了形态学观察和生化检测结果。
水生生物病毒诱导细胞凋亡机制较为复杂, 同一病毒感染宿主细胞时常常既诱导细胞凋亡又出现细胞坏死[11]。实际结果也表明, 鱼呼肠孤病毒能诱导草鱼肾细胞凋亡, 但是否同时存在宿主细胞坏死现象有待进一步研究。
郭琼林等报道[3], 在鱼呼肠孤病毒感染草鱼外周血中见到核扭曲、折叠并呈固缩、碎裂趋势的变形淋巴细胞和直径为6 10 m 核圆形、居中, 但胞浆较小的特殊小细胞, 而在病毒感染草鱼体内未发现任何脓性分泌物和中性粒细胞聚集的炎症现象出现, 但对上述现象未作解释。从作者的研究结果看郭琼林等观察到的上述现象可能是病毒诱导细胞凋亡的结果, 变形的淋巴细胞就是已处于凋亡过程中的淋巴细胞, 特殊小细胞就是凋亡小体。因为这种细胞死亡现象是启动凋亡程序, 无细胞内含物的外泄, 故无炎症发生和脓性分泌物存在。
病毒的复制与宿主细胞的凋亡是一对矛盾, 细胞的过早凋亡不利病毒的复制。为了解决这一矛盾, 某些病毒采取了抑制细胞凋亡的策略, 使其复制周期顺利完成, 例如:EB 病毒均有凋亡抑制基因[12]。本实验结果表明草鱼出血病的发病机理与FRV 诱导的草鱼细胞凋亡密切相关, 从抑制细胞凋亡的角度出发, 或许可以找到防治草鱼出血病的更佳有效方法。
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APOPTOSIS OF THE C ELL LINE FROM GRASS C ARP (CIK)
INDUCED BY FIS H REOVIRUS
QU San-pu 1, ZHANG Xiao-rong 1, ZHENG Cong -yi 1, HU Guo-bin 1,
AI Tao-shan , DING Gui-zhen , YU Yun-zhen and LIU Ying 2222
(1. Colle ge of L if e S ciences, W uhan Univer sity , Wuhan 430072; 2. W uhan Fishery Research Institu te , W uhan 430065) Abstract: In this study, the auther investigated the apoptosis induced by FRV in cultured CIK cells. The results showed that CIK cells infected w ith FRV appeared cytopathic effect (CPE) and plaques under optical microscope and the fragement of these cell nuclei w ere found. At the som etime the enlarged gap cell nuclear surrounding s were found, and blebbing from surface of cells and apoptotic bodies w ere observed in these cells under electron micro scope. In addition, agarose gel electrophoresis of DNA extracted from infected CIK cells re vealed ty pical 180 200bp integer-fold ladder bands, and Sub-G1peak in infected cells could be detected by flow cytometric method. These results indicated that FRV could induce apoptosis in CIK cells.
Key words: Fish Reovirus; Grass carp kindney cell lines; Apoptosis
6期屈三甫等:鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡 621屈三甫等:鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡图版I
1. 正常CIK 细胞形态( 200) ; 2. 病毒感染24h, CIK 细胞的CPE( 200) ; 3. 病毒感染12hCIK 细胞核裂解(N) 、核周裂隙增大( ) 和细胞出泡( ) ( 7, 000) 4. 病毒感染24h C IK 细胞出泡( ) 、核周裂隙增大( ) 和凋亡形成小体(Ap) ( 8, 000) 5. 病毒感染48h CIK 细胞的萎缩核(N) 和胞质出现空泡(Vc) ( 7, 200) 6. C IK 细胞质中膜包裹的病毒颗粒(V) ( 56, 000)
1. M orphology of normal CIK cells ( 200) ; 2. CPE CIK cells i nfected with FRV at 24h( 200) ; 3. Fractional nucleus, enlarged gap of cell nuclear surrounding an d blebbing from surface i n apoptoti c CIK cells at 12h post-infection ( 7, 000)
4. Bubbling and blebbing on surface and apoptotic bodies i n CIK cells at 24h( 8, 000) 5. Atrophic nucleus and remaining vacuoles i n CIK cell at 48h( 7, 200) 6. Virions surrounded by a membrane in cytoplasm of apoptotic C IK cells ( 56, 000)