一株产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌的选育及产酶条件的研究
第24卷第5期V o. l 24N o . 5荆楚理工学院学报
Jou rnal of Ji ng chu U niversity of T echno l ogy 2009年5月M ay . 2009
一株产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌
的选育及产酶条件的研究
朱德艳
(荆楚理工学院生物工程学院, 湖北荆门 448000)
[摘 要] 介绍了一种从土壤中选育一株产环糊精葡萄糖基转移酶(CGT ase) 的芽孢杆菌的方法。经筛选, 最终找到一株高产C GT ase 的菌株SC3-2, 鉴定该菌株为嗜碱性枯草芽孢杆菌。通过对其产酶条件的探索, 结果表明:以玉米淀粉为碳源, 以黄豆粉为氮源, 在p H 值为6. 5, 30 的条件下培养36h , 菌株所产CG T ase 的酶活力可达5046U /mL。
[关键词] 嗜碱性枯草芽孢杆菌; 菌种选育; 环糊精葡萄糖基转移酶; 产酶条件
[中图分类号] Q 936 [文献标识码] A [文章编号] 1008-4657(2009) 05-0029-04
环糊精(Cyclo m altodextri n , CD ) 是6~8个葡萄糖残基以 -1, 4键连接成的环状低聚糖, 是淀粉深加工的一类高值化产品, 6个葡萄糖为 -CD, 7个葡萄糖为 -CD , 8个葡萄糖为 -CD 。环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclo m altodextri n G lucano transferase , CGTase) 作用于淀粉后, 除了 -、 -CD 和 -[2]CD 外, 还含有葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖及其他线形糊精等多种物质, 这给环糊精的分离纯化带来了困难, 因此寻找产生特定环糊精的微生物菌种就显得十分重要。本研究自湖北荆门地区土壤中分离筛选到一种以产环糊精为主的菌株, 通过对其选育、产酶条件等的探索, 为生产环糊精奠定基础。
[1]
1 材料
1. 1 土壤样品
从湖北荆门地区的金龙泉啤酒厂、北郊粮库等附近土壤中采集土样30份。
[3]
1. 2 培养基
1) 菌种筛选培养基:可溶性淀粉10g , 蛋白胨5g , 酵母膏5g , K 2HPO 41g , M gSO 4 7H 2O 0. 2g , N a 2C O 35g , 酚酞0. 3g , 甲基橙0. 1g , 琼脂15g , 用蒸馏水定容到1000m L , 121 灭菌15m i n 备用。
2) 液体(产酶) 培养基:可溶性淀粉10g , 蛋白胨5g , 酵母膏5g , K 2HPO 41g , M gSO 4 7H 2O 0. 2g , N a 2C O 30. 2g , 调pH 7. 0, 用蒸馏水定容到1000mL, 121 灭菌15m i n 备用。1. 3 主要仪器和试剂
恒温培养箱:上海精宏实验设备有限公司制造; 超净工作台:上海净化设备有限公司制造; 721型分光光度计:上海第三分析仪器厂; FA1004电子分析天平:上海天平仪器厂。
2 方法
2. 1 菌种的筛选
取5g 土样放入三角瓶中, 加45mL 无菌水, 80 水浴处理5m i n , 静置30m i n , 取上清液稀释10倍后涂布于筛选培养基平板上, 37 恒温培养120h 。取平板上黄色透明圈较大的菌落, 溶于无菌水中,
[收稿日期]2009-03-19
[项目来源]荆楚理工学院科学研究项目(项目编号:ZR 200710) 。
[作者简介]朱德艳(1977-), 女, 湖北恩施人, 荆楚理工学院讲师。研究方向:生物制药。
重复上述操作, 进行复选3次。2. 2 菌株的诱变理
[4]
从上述筛选菌种中选出黄色透明圈较大的菌株进行紫外辐射及硫酸二乙酯(DES ) 双重诱变处
, 再接种到菌株筛选培养基平板上, 37 恒温培养120h 。测定平板上黄色透明圈的大小。
2. 3 发酵液的制备
将进行诱导后的菌株接种到产酶培养基中, 200r/mi n , 30 恒温振荡培养, 定时取样, 以测定发酵液中环糊精葡萄糖基转移酶的活性。
2. 4 CGTase 酶活性测定
取10 L 适当稀释的酶液, 加入0. 2mo l/L甘氨酸-N a OH -NaC l 缓冲液(p H 9. 0) 0. 2mL , 再加入马铃薯淀粉液0. 2mL , 振荡, 于4 水浴10m i n , 立即加入0. 5mL /L醋酸0. 5mL 终止反应, 然后加入0. 005%碘液显色。同时以蒸馏水为空白, 以不加酶液为对照, 在700n m 波长下测定吸光度(OD ), 一个酶活性单位定义为使吸光度下降10%的酶量。按下式计算:一个酶活性单位(U/mL)=(a-b) /a 1000 酶液稀释倍数式中:a 为对照的吸光度, b 为样品的吸光度。
[5]
3 结果与讨论
3. 1 产酶菌种的筛选与鉴定3. 1. 1 菌种的筛选
初选时, 取得平板上黄色透明圈较大的菌落5个, 计做C1-5号, 各菌落进行复选3次后, 根据黄色透明圈的大小, 进行比较, 结果见表1。
表1 各菌株产生黄色透明圈的大小
菌株SC1-1SC1-2SC1-3SC1-4SC1-5SC2-1SC2-2SC2-3SC2-4SC2-5
透明圈大小(mm )
5. 30. 67. 86. 36. 15. 02. 13. 20. 51. 8
菌株SC3-1SC3-2SC3-3SC3-4SC3-5SC4-1SC4-2SC4-3SC4-4SC4-5
透明圈大小(mm )
4. 110. 30. 36. 78. 49. 72. 93. 74. 61. 5
菌株SC5-1SC5-2SC5-3SC5-4SC5-5
透明圈大小(mm )
2. 88. 33. 06. 35. 1
从表1可看出:SC1-3, SC3-2、SC3-5、SC4-1SC5-2的黄色透明圈较大。
3. 1. 2 菌种的诱变
将这5株菌株进行诱导处理后, 再接种到菌株筛选培养基平板上。测定平板上黄色透明圈的大小, 结果见表2。
表2 诱变处理后菌株产生的黄色透明圈的大小
菌株SC1-3SC3-2SC3-5
透明圈大小(mm )
10. 112. 210. 5
菌株SC4-1SC5-2
透明圈大小(mm )
12. 111. 5
比较表1和表2, 可以看出, 采用紫外辐射和硫酸二乙酯双重诱导处理后, 发现酶的活性为出发菌株酶活性的1. 26倍。
3. 1. 3 CGTase 酶活性测定及菌株的鉴定
将诱变处理后的5株菌株分别接种到液体(产酶) 培养基中, 定时取样测定CGTase 酶活性, 结果见表3。
表3 5株菌株产CGT ase 酶的活性菌种
12h
SC1-3SC3-2SC3-5SC4-1SC5-2
[**************]
CGT ase 酶活力(U /mL)
24h [**************]36
36h [***********]8
从表3可看出:5株菌株都能产生CGTase , 其中以SC3-2菌株的产酶活性最高, 并且速度快。进行菌种鉴定, 发现该菌株为嗜碱性枯草芽孢杆菌。3. 2 影响菌株产酶的因素3. 2. 1 碳源对菌株产酶的影响
在发酵培养基的基础上, 分别以可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、稻米粉为碳源, 接种SC3-2菌株培养36h , 取样测定酶活力, 结果见表4。
表4 碳源对菌株产酶的影响
碳源可溶性淀粉马铃薯淀粉
CGT ase 酶活力(U /mL)
36051238
碳源玉米淀粉稻米粉
CGT ase 酶活力(U /mL)
42313829
[6]
从表4可以看出:以玉米淀粉为碳源培养时得到的酶活性较高, 其次是稻米粉。稻米粉是我们采用陈米或碎米磨成粉而成, 对于产稻米多的地区可以考虑使用。3. 2. 2 氮源对菌株产酶的影响
在发酵培养基的基础上, 分别以蛋白胨、黄豆粉、玉米浆、稻米粉、硫酸铵、尿素为氮源, 接种SC3-2菌株培养36h , 取样测定酶活力, 结果见表5。
表5 氮源对菌株产酶的影响
氮源蛋白胨黄豆粉玉米浆
CGT ase 酶活力(U /mL)
8104102590
氮源稻米粉硫酸铵尿素
CGT ase 酶活力(U /mL)
235029182
从表5可以看出:以黄豆粉为氮源培养时得到的酶活性较高, 酶的活力可达4102U /mL。稻米粉也是可以考虑选用的材料。3. 2. 3 温度对菌株产酶的影响
分别在250mL 的三角瓶中装液体(产酶) 培养基50m L , 接种SC3-2菌株, 于20、25、30、35、40、45 下培养, 36h 后取样测定酶活力, 结果见表6。
表6 温度对菌株产酶的影响
温度( )
202530
CGT ase 酶活力(U /mL)
[1**********]5
温度( )
354045
CGT ase 酶活力(U /mL)
[1**********]
由表6可见, 菌株SC3-2在30 条件下培养, 酶的活性最高, 达到4325U /mL。随着温度的升高, 酶活力下降明显, 在45 时的酶活力降至690U /mL。
3. 2. 4 p H 值对菌株产酶的影响
配置好的发酵(产酶) 培养基, 用0. 1m ol/L柠檬酸调节培养基初始p H 值为4. 0~9. 0, 接种SC3-2菌株培养36h 后测定酶活力, 结果见表7。
表7 p H 值对菌株产酶的影响
p H 值4. 04. 55. 05. 56. 06. 5
CGT ase 酶活力(U /mL)
[***********]85046
p H 值7. 07. 58. 08. 59. 0
CGT ase 酶活力(U /mL)
[***********]2
从表7可以看出:初始p H 值介于5. 5~7. 5将有利于菌株发酵产酶, 酶的活性在pH 值为6. 5时最
高, 可达5046U /mL 。
4 结语
根据有关报道活力为5400U /mL
[7-8]
, 有多种细菌可产生CGTase 。报道较多的菌种为嗜碱芽孢杆菌, 产酶水平
[9]
大多在2000~4000U /mL 。有报道用紫外线诱变等得到的高产菌株, 经摇瓶发酵40h 后, 产酶
[10]
。本文选育菌株在初步实验中的产酶达到5046U /mL, 因此有较大的潜力。
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[责任编辑:刘长青]
Breeding and Enzym atic Properties of
a Bac illus Subtilis Produc i n g Cyclo m altodextrin G l u canotransferase Z HU De-yan
(Ji n gchu Un iversity of Techno logy , Ji n g m en , H ube, i 448000, China)
Abstrac t :A n A l kali ph ilic Bac illus Subtilis SC3-2w ith high Cyc l o i na ltodextri n G lucano transferase (CGT ase) acti v ity w as screened and i den tified on the basis o f physical charac teriza tion . T he opti m ized conditi ons o f CGT ase production w ere obta i ned :m a i ze sta rch , Soy fl our , 30 , p H 6. 5, 36h , 5046U /mLCGT ase ac tiv ity w as ach i eved usi ng subme rged fer m entati on .
K ey word s :A l ka li philic Bac ill us Subtilis ; breedi ng ; Cyc l oma ltodex trin G l ucano transferase ; enzy m atic prope rties