内毒素的去除策略

第28卷第2期

2003年6月

广 州 化 学 Guangzhou Chemistry Vol. 28，No. 2 June ，2003

文章编号：1009-220X(2003)02-0038-08

内毒素的去除策略

邵英光， 李京华， 魏桂林， 王俊德

（中国科学院 大连化学物理研究所，辽宁 大连 116012）

摘 要：革兰氏阴性菌的致病性以及革兰氏阴性菌脓毒血症时出现的毒性表现是

与牢固结合在其细菌外膜中的一种大分子物质即内毒素密切相关的，文章主要介

绍了内毒素的本质和它的危害，并根据该课题组在此领域多年的研究经验，介绍

了内毒素的去除策略。

关键词：内毒素；亲和膜；去除

中图分类号：TQ464 文献标识码：A

1 内毒素的定义和结构

内毒素（Endotoxin ）又名脂多糖、类

脂A 、热源，是革兰氏阴性细菌（GNB ）

的细胞壁外壁层上的特有结构，是一种高

相对分子质量的复合物。由于内毒素具有

化学异源性[1]，不同来源的内毒素相对分子

质量变化范围可从几千到几万，且由于内

毒素的两亲性使得它在水中能够形成缔合

物，其缔合物的相对分子质量可达400,000

~ 1,000,000。

内毒素的化学成份主要是脂多糖

（lipopolysaccharide ，LPS ）。LPS 的分子结

构非常复杂，而且不同的GNB ，它的LPS

化学组成也各不相同。LPS 的化学结构主

要分为两部分：多糖和类脂A （Lipid A）。

1.1 多糖

多糖（PS ）又分为O-特异多糖（O-Antigen ）和核心寡糖（Core oligosaccharide）。

收稿日期：2002-07-08 图1 内毒素分子化学结构 细胞外部 细胞外部 脂多糖(类脂A) 核心寡糖 n = 4 ~ 40 O-特异多糖

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邵英光等：内毒素的去除策略

39 O-特异多糖——不同种属细菌产生不同的O-多糖成分，通常含4 ~ 40个单糖，包括：葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、流产菌糖、庚糖、庚酮糖酸和氨基葡萄糖等[2]。

核心寡糖——包括外核和内核。外核：己糖；内核：庚糖。

1.2 类脂A ——LPS 的毒性和生物学活性中心

内毒素的主要结构类脂A 中含有多个磷酸根结构，因而具有较低的等电点，它的等电点只有3.1。在通常的pH 条件下（pH ＞3.1），内毒素带有部分的负电荷。

类脂A （Lipid A）结构图见图2。

其分子结构由氨基葡萄糖，磷酸根，

10 ~ 18碳的长链脂肪酸组成，它与可

溶性的O-侧链及核心分离后即难溶于

水。游离后的类脂A 可自身凝聚成高

分子复合体，其相对分子质量大小不

等，同时含有疏水性的中心及亲水性

的边沿，是一种双性分子，又是酸碱

两性分子，类脂A 的独特结构使细菌

内毒素具有多种生物活性。

2 内毒素的危害

2.1 内毒素的临床作用 图2 大肠杆菌类脂A 的化学结构

内毒素对哺乳类动物有很显著的致热性。当细菌死亡或粘附在其它细胞时，才表现出毒性[3]。少量的内毒素（2 ng/kg体重）静脉注射就可以引起发烧，大剂量时可以引起血液循环障碍和内毒素休克。在正常人体内，肝脏在内毒素的清除与解毒过程中起着重要作用，使血液中的内毒素含量保持在较低水平。如果肝功能严重受损，经肠道吸收的内毒素就可通过肝脏进入体内循环，形成内毒素血症，进而加重肝脏损害，并引起肾功能减退等。据文献报道，败血症、尿路感染、脑膜炎、重症肝病、血栓性脉管炎等疾病都可能与内毒素有关。

根据国家药典的规定，药品或制剂中的内毒素含量应低于规定的限度。例如，《中华人民共和国药典》1995年第2版对普鲁卡因青霉素中的热原要求为：取本品，加灭菌注射用水制成每1 mL中含有4000单位的溶液，依照（附录XI D）家兔热原检查法，剂量按家兔体重每1 kg注射2 mL，应符合规定。对于人血白蛋白，按《生物制品细菌内毒素试验规程》

进行试验，细菌内毒素含量限值应小于2 EU/mL；干扰素中细菌内毒素的限值应小于 10 EU/mL。

2.2 内毒素产生毒性的基本机理

鉴于各种来源不同的内毒素具有类似的内毒素活性，这些内毒素的多糖组分虽然不同，但都含有类脂A 。因此，类脂A 是内毒素的活性中心。

内毒素表现出的致死毒性、热原性、诱导白细胞减少等有害作用及其他生物活性见表1。

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A. 在机体水平上 广 州 化 学 第28卷 表1 细菌内毒素在不同水平上的生物活性 B ．在细胞水平上

l 提高巨噬细胞的活性化（TNF ，IL-1.IL-6产生）

l 防止巨噬细胞游走

l 促使前列腺素的产生

l 具有抗肿瘤坏死作用

C ．在分子水平上

l 提高Hageman 因子活性化

l 提高纤维蛋白溶酶原活性化 发热性： 健康人＞1 ng ；病人＞0.2~0.5 ng ； 大剂量时具有致死毒性以及如下反应和作用： l Shwartzman 反应 l 骨髓反应（bone marrow reaction） l 白血球减少（IEUcopenia ） l 血小板减少（thrombocytopenia ） l 非特异的感染防御（nonspecific resistance） l 耐受性（tolerant ）

l 辅药作用（adjuvant ）

l 寒颤（血压低下，血管内凝固）

３　　内毒素的污染问题和检测　

3.1 内毒素自身的特点使得它无处不在

由于革兰氏阴性菌非常顽固，在水中只需极少的养分即可存活，而内毒素是革兰氏阴性菌死亡或粘附于其它细菌时，细胞壁破碎或溶解所产生的，因此，内毒素在各种溶液中及接触水溶液的器壁上都是存在的，几乎是无处不在。

3.2 内毒素具有潜在的生物学效应

内毒素在体内外均有明显的生物学作用。在游离细胞系统中，纳克级浓度的内毒素就能影响特定种类细胞的行为，甚至影响分子的行为，从而影响正常的生理活动。

因此，内毒素是大多数生物材料的污染源，它的存在使得目前许多生物、药物试验出现混乱的结果，给生产带来了许多困难。（1）药品的污染。如化学方法合成的种类繁多的西药、从植物中提取的中药，在其合成或提取的过程中有可能被内毒素所污染。（2）生产原料。各种血液制品和细胞培养基在制备过程中也会或多或少被污染。（3）生物制剂。如干扰素、白介素或由重组DNA 技术制造的各种具有治疗作用的蛋白质或多肽、在制造过程中采用大肠杆菌作为表达的载体，或种种外界因素，均很难避免内毒素的污染。为此，国家药典明确规定了药品中内毒素的最高限度和检测方法，例如传统的家兔热原检查法，还有鲎试剂内毒素检查法，故内毒素污染问题严重影响着医学、药学试验和各种药物的生产质量。

3.3 内毒素的检测

3.3.1 家兔热原实验法（Rabbit Pyrogenic Test，RT ）

此方法即将一定量的被检标本（药品）静脉注射入家兔体内，观察其注射后的发热情况，以决定所检标本中有无热原的存在。RT 法为一种定性检测内毒素的方法，应用历史较久。此方法本身有许多限制，如家兔对内毒素的反应有个体差异、敏感度不高、不能定量测出内毒素等。

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41 3.3.2 鲎实验法（Limulus Test，L T ）

L T 法又称鲎变形细胞溶解物实验（Limulus Amoebocytelysate，LAL ），是目前检测内毒素最敏感的方法。它比RT 法敏感10 ~ 100倍以上，可测出微量的内毒素（0.01 ~ 1 ng/mL），用微量光电法及其它改进方法可检测到微微克（pg/mL）的水平。而RT 法中，敏感性高的家兔需注射1.5 ng/kg才能引起发热，而敏感低的却需注射0.5 ~ 10μg /kg才能引起发热。L T 法已经逐步应用到部分药品中内毒素的检测，但由于影响L T 法的干扰因素甚多，L T 的标准化问题（包括内毒素及鲎试剂的标准化，以及操作程序的标准化等）至今还在完善，故无法应用于所有药物中内毒素的检测。

3.3.3 其它检测方法

使用化学方法，就是用气相色谱仪检查内毒素中类脂A 上的羟基豆蔻酸，但此法敏感度不高，操作复杂，同时不能证明所测的内毒素是否仍然具有生物活性。还有家兔肾上腺皮肤试验、半数局部斯氏现象皮肤反应预备剂量（SPD 50）测定、鸡胚半数致死量（CELD 50）测定等均可以用于内毒素的检测，但敏感性较低，方法复杂，差异性较大。

总之，从目前来看，L T 法为检测内毒素的最好方法。其主要优点是敏感性高，假阳性少，且设备简单，实验时间短等。如能解决标准化问题，L T 法将是检测内毒素的最好方法。 4 内毒素的去除

4.1 内毒素去除是一个难题

内毒素的化学本质说明了从水溶液中消除热原是个难题。这种分子的热稳定性极高，在250℃干热下长达1 h才会被分解。这种分子对pH 值变化也不敏感，但高浓度的酸或碱可使之失活。

内毒素分子由于具有磷酸基团而带负电荷，因此理论上可以用带正电荷的吸附剂来去除。然而，实际上这种结合效果不佳。其原因一方面是天然存在的内毒素分子上所携带的磷酸基团（负电荷）已经被阳电荷的离子（Ca 2＋，Mg 2＋，Na ＋，K ＋ 等）或多胺（尸胺、精胺、亚精胺、乙醇胺）等中和；另一方面，在自然界中内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，内毒素分子与本身所携带的负电荷参与了聚合体的形成，很少由游离的负电荷暴露在集聚体外表。因此，在溶液中去除内毒素污染或消除内毒素便成了生物研究中的一个难题。

4.2 内毒素的消除

在水溶液中去除内毒素，据报道有以下六种方法。

4.2.1 超滤膜和荷电微孔滤膜法

由于内毒素具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除水中的内毒素。超滤膜的孔径及材质的选择，需视被处理药物的相对分子质量、特性、及药品中热原的含量而定。如要截留大部分热原，需采用截留相对分子质量为5000或10000的超滤膜，此时操作过程中的压力较高，另外对部分含有较大相对分子质量成份的医药制剂也不合适。因为在除去热原

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的同时会阻留或吸附药液中的有效成份，使产品收率大受影响[4]。 第28卷 由于内毒素分子在中性条件下本身带负电荷，因而选择带有正电荷的材质如聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等微孔滤膜可增强对内毒素分子的去除效果[5,6]，另外，也有人将硅藻土涂渍在纤维素膜上，然后在其上吸附上荷正电聚电解质，用于去除内毒素[7]。但这些荷电微孔滤膜对内毒素的去除效果受pH 的影响较大。

4.2.2 石棉及活性炭吸附法

活性炭用于去除内毒素[8]是由于内毒素的相对分子质量较大，这种方法适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中内毒素的去除。比较适合纯水溶液中内毒素的去除。但由于活性炭的选择性较差，易吸附有效成份，且纯化后溶液中的残余活性炭不易去除，因此目前已很少使用[9]。

4.2.3 化学降解法

化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂[10]等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。这种方法有可能造成目标产物的流失、降解或失活，因此对于具有生物活性物质溶液中的内毒素去除显然是不利的。

4.2.4 相分离法

Liu 等[11]发展了一种采用Triton X-114从大量重组体蛋白制品中去除内毒素的方法。据此文报道，利用这种相分离法，对内毒素的去除率达99%以上，对蛋白质的回收率大于90%，且不影响有效成份的活性。

4.2.5 离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。如二乙基胺乙基（DEAE ）阴离子交换介质适于从碱性蛋白质中去除内毒素[13]，成本低，吸附容量大。

Chibata 等人[14]采用一种以吸附剂吸附溶液中的内毒素的方法去除内毒素。吸附剂由不溶于水的载体（如Cellulose ）和含氮杂环的化合物（R-A-X ）组成，其中R 是含氮杂环基团，A 是烷基或链烯基，X 是H 原子或作用基团。含氮杂环和烷基可由一个或多个取代物选择性取代，此化合物直接或通过间隔臂连接到载体上。

4.2.6 亲和色谱法

亲和色谱法是利用物质的生物学特性来达到物质的分离，是去除内毒素的一种较为理想的方法。只要采用适当的配基，将它固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，就可使它成为一种去除内毒素的高效能、高选择性方法。相对于上述方法来说，亲和色谱法具有其显著的优越性，去除率高、选择性好。

自80年代起，组胺、组氨酸就开始用作去除内毒素的亲和配基。Satoshi Minobe等[9,15,16]报道，以组氨酸为配基的柱介质在低离子强度（I = 0.02），pH 3 ~ 8的条件下，对内毒素的去除效果最好。商振华等[17~19]在此基础上制成了以组氨酸为配基的聚酰胺膜介质，在所选择的最佳条件下成功地应用于BSA 、溶菌酶等生物制剂中内毒素的去除。Legeklallails 等[20]则成功地利用组氨酸为配基的中空膜（PEVA ）去除了IgG 中的内毒素。

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4.3 亲和膜分离系统在内毒素去除上的应用

我们基于亲和色谱法开发了一种亲和膜分离系统，用于去除各种溶液中的内毒素。亲和膜分离系统的主体亲和膜主要是以纤维素膜等为基材，通过化学方法键合不同的配基，这些配基对于内毒素分子或聚集体具有较强的吸附作用，亲和膜合成工艺见图3。

常用膜基质及改性

维生素

聚酰胺

聚砜膜

聚乙烯 理想亲和介质 的特点 环氧氯丙烷 戊二醛 双环氧试剂 三氯三嗪 己二胺 基团特异性 生物特异性 特点及选择 基 质

图3 亲和膜研制的工艺过程

通过上述工艺制成的亲和膜对于溶液中的内毒素具有很强的特异吸附，它对内毒素的吸附原理见图4所示。

亲和基体 间隔臂 配基 其他物质或水分子 填充样液 吸附

内毒素分子

再生 洗脱 洗涤

内毒素分子 图4 亲和膜去除内毒素机理

这种亲和膜具有以下特点：

(1) 特异性吸附。这种膜具有很高的选择性，仅对内毒素具有很好的吸附，对于其它物质例如白蛋白、干扰素等吸附很小，使得溶液经过膜处理后，有效物质的回收率很高。

(2) 吸附量大、去除率高。所制备亲和膜的吸附容量很大，用于水中内毒素的去除，吸附量高于2.4×106 EU/g膜（EU 为内毒素重量单位，1 EU≈120 pg），对于其它生物试剂或溶液，经过膜的反复处理也可以达到很好的去除效果。

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(3) 膜可以再生使用。膜可通过碱处理法再生，方法简单有效，可反复使用10 ~ 20次。

(4) 膜通透性好、有一定的耐酸碱性。采用专利技术来制备亲和膜分离器，溶液通过膜的流速可以达到100 mL/min，压力不超过0.2 MPa，缩短了工作时间，提高了处理量。溶液在pH 值3 ~ 11范围内均可以用来处理。

由于亲和作用是个极其复杂的物理、化学和生物相互作用过程，不仅与亲和介质本身的物化性质、结构、间隔臂的种类和长短、配基的性质和含量、配合物的分子构型和性质有关，而且还受配基和配合物相互作用时的周围环境和条件（如盐或缓冲液的性质和种类、离子强度、pH 值、温度、流速等）的影响。特别是对于来源千差万别、相对分子质量很大（数十万到数百万）、结构又很复杂的内毒素来说，更需研究各种外界条件对亲和介质去除内毒素效果的影响，以便选择既能有效去除内毒素，又不影响目标产品回收率的最佳条件。为此，我们系统考察了间隔臂、离子强度、pH 值、流速等因素对亲和膜去除内毒素效果的影响，优化了亲和膜去除内毒素的条件，从而达到良好的去除效果。例如我们曾用这种亲和膜法做过人血白蛋白溶液中内毒素的去除实验：100 mL 人血白蛋白乙酸溶液（含有一定量的内毒素），蛋白浓度2%，pH 值3.9，通过亲和膜，流速为15mL/min，内毒素去除率在90%以上，蛋白回收率在80%以上。但是，使用此方法白蛋白的回收率受pH 值影响，当pH 值＞6以后，随pH 值升高，白蛋白的回收率最后只有百分之几。

5 亲和膜用于内毒素去除的前景展望

由于生物制品（如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等，以及其它血液制品）在未来的基础研究和临床治疗中前景诱人，尤其是将具有治疗作用的蛋白质经生物工程技术在大肠杆菌中表达，所得到的产物中含内毒素相当丰富，故生物工程的药物生产面临着内毒素的去除问题。亲和膜法去除内毒素这一技术，对于内毒素具有高度的选择性，是高效又容易操作的去除热原方法，为生物工程提供了去除内毒素的十分有效的技术。

病人体内的内毒素去除是个难题，目前的去除方法都不能够很好地用于病人体内内毒素的去除，从这一点看，我们所做的亲和膜法去除内毒素在今后的临床病人应用上会有很大的应用前景。对于内毒素，人们主要关心的是它的毒性及如何去除。近些年，曾有人提出内毒素中和剂法，就是用一种或几种物质（无害的）与内毒素分子进行结合，形成一种新的物质，而此物质对于人体又无害。如果是那样的话，我们去除人体内的内毒素就和吃药一样方便了。这种方法的关键就是找到一种既跟内毒素有很强的结合能力又对人体无害的物质，或者可以人工合成此类物质。如果能够成功，将在内毒素的去除上迈出具有里程碑的一步。

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Methods for Endotoxin Removal

SHAO Ying-guang， LI Jing-hua， WEI Gui-lin， WANG Jun-de

（Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116012，China ）

Abstract ：The essentiality and harm of endotoxin are introduced in this article，and on the basis of our experience in this field，some methods of endotoxin removal are reported.

Key words：endotoxin ；affinity membrane；removal