黑豆与黄豆大豆甙元的HPLC测定方法研究[论文]
黑豆与黄豆大豆甙元的 HPLC 测定方法研究
摘要：采用高效液相色谱法（hplc），能够快速、有效建立检测黑豆、黄豆的大豆甙元成分的检测方法。结果： hplc法可以有效的分理出黑豆以及黄豆的大豆甙元，在色谱条件等不变的情况下，甲醇：水：乙酸=42：57：1的流动对于分离两者的效果都较好，获得的图谱十分清晰，测定的成分峰形以及保留时间较为满意。hplc法能够同时检测出黄豆和黑豆提取物异黄酮中的大豆甙元含量，方法简单、快速，精密度高且重现性能好。
关键词：大豆甙元 hplc 黑豆与黄豆
大豆甙元又名大豆素； 黄豆苷元； 大豆黄酮； 4，7-二羟基异黄酮大豆甙元隶属于黄酮类化合物，是异黄酮的一种，也是植物雌激素的一种。它可以从植物中提取，具有雌激素功能，是非甾类化合物[1]。研究表明大豆甙元不溶于水，呈固态，应用高效的检测方法是研发大豆甙元的技术基础，高效液相色谱法（hplc）作为一种先进的检测技术，就能够十分有效的检测出大豆甙元。
1、材料与方法
1.1黑豆、黄豆样品 选取小黑豆，吉林32、吉林35；吉黄豆1号，吉黄豆2号，平安8、吉林47、gr8836，随机挑选60粒种子均匀粉碎，40日后称取100mg的粉样，加入4ml80%甲醇，常温下静置
2.5h，80℃水浴14小时，对12000g的物质离心15min，对预处理液用滤膜进行过滤，过滤的上清液倒入hplc专用的玻璃瓶封口4℃保存。
1.2仪器 高效液相色谱仪（lc-20a），产自日本岛津公司； 超声仪、低温高速离心机，产自昆山市超声仪器有限公司；高速粉碎机，产自北京中兴伟业仪器有限公司；减压蒸发器、电热恒温水浴锅、分析天平，产自上海一恒科技有限公司。
1.3试剂 甲醇（hplc级、分析纯），乙腈（ 色谱纯），甲醇（ 色谱纯），产自美国fiser公司；乙腈（色谱纯），乙酸（分析纯），磷酸（分析纯），来自山东禹王试剂；乙醇（分析纯），来自北京化工厂；二次重蒸水，来自哇哈哈纯净水；食用酒精；染料木素，纯度≥9 8%，日本进口； 标准大豆苷、 苷元、 染料木苷。
1.4色谱条件 色谱柱：c18柱（150 mm×4.6 mm，5.0 um；检测波长：260nm；流动相：水：甲醇：乙酸=57：42：1；流速：1ml/min；柱温：常温；进样量：10 ul；分析时间，每份样品45～55min。每份样品平行测量3次，再求峰面积的平均值，根据峰面积定量，依照时间定性，根据标准品的标准曲线计算样品中的大豆甙元的量。
1.5测量方法
1.5.1标准溶液的制备及曲线绘制 精密称取大豆甙元10mg，放于10ml的容量瓶中，甲醇溶解，摇匀充当标准溶液贮备液。再精密称取储备液2ml，甲醇定容至5ml，过滤膜过滤，充当标准对照品的使用液。用10ul标准对照品的使用液，按照以上色谱条件，用hplc分离测定出吸收峰面积。吸收峰面积为y轴，组分浓度为x轴绘制标准曲线，观察线性关系。
1.5.2大豆甙元活性成分检测 精密称取大豆及黑豆乙醇提取物
1.5g，加30ml80%的乙醇，离心20min，微孔滤膜过滤，制备供测样品液。以标准样品溶液的分离测定方法进行研究分析，计算样品中大豆甙元的含量。
2、结果
2.1流动相选择结果 分别选取a甲醇：0.4%磷酸=55：45；b含5%乙酸和25%甲醇水溶液；c甲醇：水：乙酸=42：57：1；d0.05%磷酸和乙睛梯度洗脱。4种流动相进行分离检测出的黄豆、黑豆醇提取物中的大豆大豆甙元，详细结果见表1。
结果表明在色谱条件等不变的情况下，甲醇：水：乙酸=42：57：1的流动对于分离两者的效果都较好，各个组分的分离度都不错，所以确定甲醇：水：乙酸=42：57：1为流动相进行的样品分析。
2.2标准曲线的线性关系分析 色谱条件同样不便，精密吸取10ul不同浓度的标准对照品液，测定大豆甙元的吸收峰面积，测定结果见表2.
将吸收峰面积作为y轴和组分浓度作为x轴进行线性回归分析，得到的黄豆大豆甙元和黑豆大豆甙元回归方程分别为：y=2.49×107x+6.8×105r=0.894039765；y=2.55×107x+7.5×
105r=0.995034708.线性范围分别是，黄豆大豆甙元0ug/ml～350ug/ml、 0ug/ml～270ug/ml.
3、讨论
本组实验表明hplc法可以有效的分理出黑豆以及黄豆的大豆甙元，流动相的比例以及配比对于最后的实验结果影响较大。在色谱
条件等不变的情况下，甲醇：水：乙酸=42：57：1的流动对于分离两者的效果都较好，获得的图谱十分清晰，测定的成分峰形以及保留时间较为满意。
我国是著名的黑豆出口大国，在黑豆加工方面做得不足，深加工方面更是处于空白地带。黑豆中的维生素、黄酮和黑色素，具有提高人体免疫力和改善睡眠等保健作用，其中的大豆大豆甙元具有扩张血管，增加冠脉流量，降低血压，减慢心律和降低心肌耗氧量及抗心律失常作用，并且对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有显著的抑菌作用。能增加小鼠的体重和免疫器官的重量抗心律失常作用[2]。雌激素样作用，治疗更年期综合症抗骨质疏松，抗雌激素活性，防治乳腺癌、子宫内膜炎抗缺氧作用。
hplc法的高效分离技术，对黑豆和黄豆乙醇提取物中大豆苷元分离检测方效果较好，是一种快捷有效的检测方法，为 大豆异黄酮的微生物转化及高活性黑豆大豆异黄酮保健品的开发打下良好的技术基础。
参考文献：
[1]刘占云， 刘岱琳， 白淑芳等. hplc 测定不同产地黑豆皮中表儿茶素的含量[j]. 食品研究与开发， 2011， 32（10）.
[2]李剑梅， 桓明辉， 王振丽， 等. hplc 法检测黑豆乙醇提取物中活性成分的含量[j]. 食品研究与开发， 2007， 28（5）： 108-110.