分子植物育种

分子植物育种，２００６年，第４卷，第６（Ｓ）期，第８３－９０页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．６（Ｓ），８３－９０

专题介绍Ｒｅｖｉｅｗ

ＲＮＡｉ技术及其在作物遗传育种中的应用

卢东长城１，２梁荣奇２＊

１首都师范大学生命科学学院，北京，１０００３７；２北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京，１０００９７＊通讯作者，ｌｉａｎｇｒｑ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

摘要Ｆｉｒｅ等（１９９８）发现在线虫中双链ＲＮＡ可以有效地阻断同源基因的表达，并将这一现象称为ＲＮＡ

干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ），从而获得了２００６年的诺贝尔生理学／医学奖。ＲＮＡ干扰是指由双链ＲＮＡ引发的专一性沉默同源基因的现象，它可以专一性降解同源基因的ｍＲＮＡ或修饰同源基因的启动子。目前有

３种转基因方法可以引起植物内源基因的ＲＮＡ沉默：产生双链ＲＮＡ转录本的反向重复ＲＮＡｉ（ＩＲ－ＲＮＡ）、反义ＲＮＡ（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅＲＮＡ）技术和正义过量表达外源基因（ｓｅｎｓｅＲＮＡ）。ＲＮＡｉ技术作为一种下调表达技术，现在已经开始应用于许多作物的遗传改良以及外来病毒的基因沉默。本文综述了目前ＲＮＡｉ技术在作物重要功能基因的鉴定、抗病毒作物的培育、降低有害物质含量或提高有益物质含量以改良作物品质、增加工业原料的含量等方面的研究进展。随着人们对作物代谢调控和ＲＮＡｉ机制的进一步认识，ＲＮＡｉ技术必将在作物遗传育种中得到更为广泛地应用。

关键词ＲＮＡ干扰，遗传育种，小干扰ＲＮＡ，功能基因组

ＲＮＡｉａｎｄｉｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ

ＬｕＤｏｎｇｃｈａｎｇｃｈｅｎｇ１，２ＬｉａｎｇＲｏｎｇｑｉ２＊

１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＣａｐｉｔａｌＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００３７；２ＢｅｉｊｉｎｇＡｇｒｏ－ＢｉｏｔｅｃｈＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＢｅｉｊｉｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００９７

＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｌｉａｎｇｒｑ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

ＡｂｓｔｒａｃｔＦｉｒｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｃｏｕｌｄｖｅｒｙｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｓｕｐｐｒｅｓｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｈｏｍｏｌｏｇｉｃａｌｇｅｎｅｉｎ１９９８，ａｎｄｔｈｉｓｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｗａｓｔｅｒｍｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）．ＲＮＡｉｉｓａｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅｓｉ－ｌｅｎｃｉｎｇｐｈｅｎｏｍｅｎａｔｈａｔｉｓｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｄｉｒｅｃｔｅｄａｇａｉｎｓｔｍＲＮＡｏｆａｇｅｎｅｏｒｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆａｇｅｎｅ．ＴｈｅｒｅａｒｅｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｔｈａｔｃａｎｔｒｉｇｇｅｒｔｈｅＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｅｎｄｏｇｅ－ｎｏｕｓｐｌａｎｔｇｅｎｅｓ：ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｓｅｎｓｅｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｒａｎｓ－ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｓａｋｎｏｃｋｄｏｗｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｈａｓｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏａｗｉｄｅｒａｎｇｅｏｆｓｐｅｃｉｅｓｔｏｓｉｌｅｎｃｅｔｈｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓａｎｄｇｅｎｅｓｏｆｉｎｖａｄｉｎｇｖｉｒｕｓｅｓｆｏｒｃｒｏｐｇｅｎｅｔｉｃｓｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｔｈｅａｄｖａｎｃｅｓｏｆｉｔｓａｐｐｌｉ－ｃａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｖｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｃｒｏｐｔｒａｉｔｓｂｙｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｄｉｓｐｒｏｄｕｃｔｓｃｏｎｔｅｎｔｏｒｉｎ－ｃｒｅａｓｉｎｇｄｅｓｉｒｅｐｒｏｄｕｃｔｓｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅｂｅｎｅｆｉｔｔｏｉｎｄｕｓｔｒｙｉｎｃｒｏｐｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｂｒｅｅｄｉｎｇｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．ＬｅａｒｎｉｎｇｍｏｒｅａｂｏｕｔｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｐａｎｄＲＮＡｉｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｗｏｕｌｄｍａｋｅＲＮＡｉｍｏｒｅｗｉｄｅｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｆｏｒｃｒｏｐｇｅｎｅｔｉｃｓｂｒｅｅｄｉｎｇ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＲＮＡｉ，Ｃｒｏｐｇｅｎｅｔｉｃｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｓｉＲＮＡ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｅ

为了克服传统育种方法的局限，利用遗传工程技术引入基因获得新性状、或者消除基因去掉坏性状，已经广泛地、成功地应用于植物遗传改良和育种中。近年来，转录后基因沉默（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）已广泛地用于下调（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕ－

ｌａｔｅ）植物代谢过程中的某些关键酶。ＰＴＧＳ发生在细胞质中，基因能够转录产生ｍＲＮＡ，但ｍＲＮＡ在细胞质中被特异性地降解。

最近，植物ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）技术已经用于高效、特异地沉默特定的植物基因

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分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，２０００；Ｋｕｓａｂａ，２００４；Ｊｏｎｅｓ，２００５）。ＲＮＡｉ

并以之为模板合成ｄｓＲＮＡ。细胞中的ＲＮａｓｅⅢ家族

被Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志评为２００１、２００２年度自然科学１０大成员将ｄｓＲＮＡ结合降解成２１￣２３ｎｔ的小干扰ＲＮＡ突破之一，是目前分子生物学和遗传学研究热点。（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）。在果蝇中，这种

其中一条Ｆｉｒｅ和Ｍｅｌｌｏ因在ＲＮＡｉ研究中做出了开创性工作ＲＮａｓｅⅢ被称为Ｄｉｃｅｒ酶。ｓｉＲＮＡ解螺旋，而获得了２００６年的诺贝尔生理学／医学奖。ＲＮＡｉ技术已经成为功能基因组研究、基因工程和生物医学的重要研究方法之一。

链（一般偏好于反义链）进入ＲＮＡ诱导沉默复合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）。ｓｉＲＮＡ的反

义链随即与ｍＲＮＡ杂交，引导ＲＩＳＣ在其附近对ｍＲＮＡ进行切割。ｓｉＲＮＡ也可能被装配到ＲＮＡ诱导转录沉默复合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｓｉｌｅｎｃ－ｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＴＳ），进而引起包括ＤＮＡ和组蛋白甲基化在内的染色质沉默（Ｖｅｒｄｅｌｅｔａｌ．，２００４）。１．３ＲＮＡｉ技术分类

ＲＮＡｉ技术，就是将体外合成的ｄｓＲＮＡ（１９￣２３ｂｐ）导入生物体，或者经过适当构建的在生物体内能表达形成ｄｓＲＮＡ的特殊结构载体导入生物体，引起内源同源基因的表达抑制。

与传统的理化诱变、Ｔ－ＤＮＡ插入突变等方法相比，ＲＮＡｉ技术具有以下优越性（Ｈａｎｎｏｎ，２００４；黄冰艳，２００４）：①特异性：序列特异性的ＲＮＡ及其蛋白质功能丧失或降低，从而无需大量筛选、鉴定和分离突变植株；②高效性：少量ｄｓＲＮＡ就能导致内源基因几乎１００％的沉默；③多效性：通过仔细地选择靶基因序列片段（植物ＲＮＡｉ一般为６００￣１０００ｂｐ），可

１ＲＮＡｉ的机理和分类

１．１ＲＮＡｉ的发现

Ｎａｐｏｌｉ等（１９９０）将由强启动子控制的色素基因ＣＨＳ（查尔酮合酶）导入矮牵牛，以加深花的紫色，结果发现许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。他们把这一现象称之为共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ），用以定义所转入外源基因和同源内源性基因的表达同时减弱的现象。随后，Ｇｕｏ和Ｋｅｍｐｈｕｅｓ（１９９５）在线发现正义ＲＮＡ和反义ＲＮＡ虫的ｐａｒ－１基因研究中，都可以抑制基因的功能。

Ｆｉｒｅ等（１９９８）研究证明，在正义ＲＮＡ阻断基因而这些双表达试验中，真正起作用的是双链ＲＮＡ，链ＲＮＡ是体外转录正义ＲＮＡ时生成的，并将这一现象称为ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ。在后来的实验中，人们在植物（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔｅｔａｌ．，１９９８；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．，２００１；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９９）、真菌（ＣｏｇｏｎｉａｎｄＭａｃｉｎｏ，

选择性沉默某一基因家族中的单个基因、部分甚至

④可选择性：通过采用不同的涡虫（Ｓáｎｃｈｅｚ－ＡｌｖａｒａｄｏａｎｄＮｅｗｍａｒｋ，１９９９）、全部家族基因的表达；１９９７）、

如诱导型、组织特异型，来抑制某一发育阶果蝇（ＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌａｎｄＣａｒｔｈｅｗ，１９９８）、小鼠（Ｗｉａｎｎｙ启动子，

某一器官的基因表达。ａｎｄＺｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚ，２０００）等多种生物中发现了段、

有３种转基因方法可以引起植物内源基因的ＲＮＡｉ现象，所以认为，ＲＮＡｉ是真核生物中普遍存在

ＲＮＡ沉默：产生双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）转录本的反向重的现象，ＲＮＡｉ是生物进化过程中比较保守的机制。

复转基因（ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，

１．２ＲＮＡｉ的作用机理

ＩＲ－ＲＮＡｉ），反义ＲＮＡ技术（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅＲＮＡ）和正义过

ＲＮＡｉ在两个不同的水平上起作用：一是在转录量表达外源基因（又称Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ）（表１）。后基因沉默（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴ－多年来，人们已经使用反义ＲＮＡ技术研究了很ＧＳ），其特点是基因能够转录出ｍＲＮＡ，但ｍＲＮＡ被多基因的功能，在果实性状及品质改良、提高作物的迅速地降解，从而失去功能；二是转录基因沉默（ｔｒａｎ－抗病性上都有广泛的应用。其基因操作也较ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＴＧＳ），相应基因座上的ＩＲ－ＲＮＡｉ简单，所以虽然它沉默效率和稳定性不高，ＤＮＡ和组蛋白发生甲基化修饰，改变ＤＮＡ或染色质的结构，从而抑制基因的转录。共抑制现象通常和ＰＴＧＳ和ＴＧＳ两个水平相关（Ｋｕｓａｂａ，２００４）。

这两种水平的ＲＮＡｉ都和双链ＲＮＡ（ｄｏｕ－ｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）相关。ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶（ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲＰ）可识别异常ＲＮＡ（病毒ＲＮＡ、细胞内异常表达的ＲＮＡ）

但目前仍然是作物遗传育种中重要的分子生物学技

术之一。

反向重复ＲＮＡ干扰（ＩＲ－ＲＮＡｉ）转基因技术通常是这３种方法中最有效的，具有高效而稳定的特点。

最有效的双链ＲＮＡ构件是能转录发植物ＲＮＡｉ中，

夹ＲＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ，ｈｐＲＮＡ）（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，２０００）。在这种类型结构中，靶序列的２个拷贝作为反向重

ＲＮＡｉ技术及其在作物遗传育种中的应用

ＲＮＡｉａｎｄｉｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ

表１三种ＲＮＡｉ技术的特点

Ｔａｂｌｅ１ＣｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆｔｈｒｅｅＲＮＡｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ方法ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡＩＲ－ＲＮＡｉＳｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ

结构Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ反义链Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｓｔｒａｎｄ反向重复序列Ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｓ正义链Ｓｅｎｓｅｓｔｒａｎｄ

对拷贝数的要求Ｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ未见报道Ｎｏｒｅｐｏｒｔ＜３个拷贝＜３ｃｏｐｉｅｓ不要求Ｎｏ

效率和稳定性Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ效率低、稳定性差Ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｕｎｓｔａｂｌｅ效率高、稳定性好Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｓｔａｂｌｅ

高拷贝时，效率高、稳定性好Ｗｈｅｎｈｉｇｈｃｏｐｙ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅ

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操作难易程度Ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ简单Ｅａｓｙ较复杂Ｍｏｒｅｄｉｆｆｉｃｕｌｔ简单Ｅａｓｙ

复序列而被串联插入，在反向重复序列中间一般插

入一个内含子。Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ和Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ评价了植物中３类高通量基因沉默的表达载体及其构建方法，认为将间隔区内含子（ｓｐａｃｅｒｉｎｔｒｏｎ）插入反向互补重复区，可以增强其稳定性（Ｗｅｓｌｅｙｅｔａｌ．，２００１）。植物ＲＮＡｉ除了比Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ和反义ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ）更稳定高效外，在抑制多基因家族基因方面比基因突变更具优势（Ｋｕｓａｂａ，２００４）。Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ等（２００２）研究表明基因抑制效果可在子代稳定遗传，首次明确了该技术在作物遗传改良方面的应用潜力。目前，大部分的研究都围绕ＩＲ－ＲＮＡｉ进行。但事实上，反向重复ＲＮＡ在生物体中也是一种异常ＲＮＡ，尤其是在转基因高拷贝时，可能被细胞内的ＲＮＡｉ系统所识别，反向重复ＲＮＡ的转录就会被这个系统所沉默。如果出现这样的情况，就不能达到通过ＩＲ－ＲＮＡｉ沉默相应基因的目的。在矮牵牛查尔酮合酶（ＣＨＳ）的ＩＲ－ＲＮＡｉ研究中发现转基因拷贝数达到３个或３个以上的转基因植株的查尔酮合酶基因沉默水平较拷贝数１个或２个的转基因植株明显降低（Ｓｉｊｅｎｅｔａｌ．，２００１）。同时，由于反向重复的存在，可能会出现因为同源重组导致反向重复丢失的现象。

共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ）可简单定义为所转入的外源基因和同源内源性基因的表达同时减弱的现象，是与外源基因和同源内源性基因共表达（ｃｏｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎ）状态相反的一种状态（Ｎａｐｏｌｉｅｔａｌ．，１９９０；ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌｅｔａｌ．，１９９０）。由于共抑制的含义主要指一种结果（而不是一种机制），因此，转录或转录后基因沉默都可归因于共抑制的发生。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（２００５ｂ）等将Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ作为一种功能基因组方法来研究特异细胞或组织中变异的发生。但是，目前Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ技术进行基因功能研究的报告很少，因为Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ低拷贝转基因时有与反义ＲＮＡ技术同样的沉默效率和稳定性不高的缺点。但是在Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ转基因的拷贝数较高的情况下，Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ的沉默效率和

稳定性会大为提高。这一点为Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ技术在作

物遗传育种上提供了广阔的应用前景，因为目前基因枪仍然是大多数的单子叶作物的遗传转化的主要手段，而基因枪转化很容易得到高拷贝的转基因植株，不易得到单拷贝或者低拷贝的转基因植株。

２ＲＮＡｉ在作物遗传改良中的应用

２．１农作物重要功能基因的鉴定２．１．１ＲＮＡｉ在反向遗传学上的应用

将功能未知的基因编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达，在转基因个体内就可转录出ＲＮＡ形成ｄｓＲＮＡ，产生ＲＮＡ干扰，使目的基因静默，进一步研究目的基因的功能。

高等植物的基因组存在大量的冗余。传统的插入突变导致一个基因家族的某一个成员失活后，家族的其他成员可以弥补其功能，这样往往观察不到基因对应的表型。ＲＮＡｉ技术可以简单快速地抑制一个基因的表达，而且能够通过选择不同的作用位点分别或同时作用于同一基因家族的若干个成员，因此ＲＮＡｉ技术是研究基因家族功能的理想工具。ＲＮＡｉ技术引起的突变是显性的，因此杂合的突变株就可以观察到突变表型，而ＲＮＡｉ载体的插入位点一般不会影响沉默效果。因此ＲＮＡｉ技术的操作更为简单易行，目前ＲＮＡｉ技术已经十分广泛地应用于基因功能的反向遗传学研究，例如Ｌｅｅ等（２００４）利用ＲＮＡｉ技术和过表达操作研究ＯｓＭＡＤＳ５０基因的功能，表明ＯｓＭＡＤＳ５０是水稻中控制多种开花相关调控因子的重要开花活化因子，Ｇｕｐｔａ等（２００２）用ＲＮＡｉ抑制拟南芥菜ＡｔＰＴＥＮ１基因在花粉粒中的表达，导致花粉细胞在有丝分裂后死亡推测ＡｔＰＴＥＮ１基因是和花粉特异磷酸酶有关的基因，对花粉发育有重要作用，Ｍｉｙｏｓｈｉ等（２００３）用ＲＮＡｉ技术抑制３个ＯｓＨＡＰ３基因的表达，发现这３个ＯｓＨＡＰ３基因中

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的１个或多个基因控制核编码的叶绿体目标基因的表达和叶绿体的正常发育。

但是用ＲＮＡｉ技术得到的突变植株，不能通过转入野生型基因的方法恢复野生型，也就不能通过功能互补的方法来证明突变表型确实是由此目的基因的失效引起的。Ｓｉｊｅｎ等（２００１）利用ＴＧＳ来抑制ＲＮＡｉ载体上３５Ｓ启动子的活性，使野生型得到恢复。这个实验体系可以很好地说明突变表型确实是由ＰＴＧＳ引起的而和外源片段的插入无关。２．１．２用ＲＮＡｉ技术构建突变体库

在功能基因组研究中，人们通常先用物理、化学的方法或者Ｔ－ＤＮＡ法、转座子法构建一个突变体库，然后从这个库中挑选兴趣的突变型进行研究，找到相关的基因。

目前，ＩＲ－ＲＮＡｉ技术作为反向遗传学技术广泛应用于１个或几个植物基因的功能研究，但由于要构建含有反向重复序列的载体，因此很难应用于大规模的植物功能基因组研究。

构建一个由强启动子启动的载体，把ｃＤＮＡ文库或者３＇－ＵＴＲ文库插入到强启动子后面，然后用这个文库转化植物，就可以得到大量Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ植物。因此，Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ有可能成为可用于大规模的植物功能基因组研究的一项新技术。２．１．３用ＶＩＧＳ技术研究基因功能

传统的正向遗传学方法通常包括Ｔ－ＤＮＡ或转座子的插入突变。这些方法帮助人们发现了很多基因，但如果要研究的基因是细胞基本活动或个体早期发育所必需的，由于插入通常引起基因的完全失活，因此一般不能得到突变型胚细胞，或得到胚细胞却无法观察到基因产物在植物整个发展过程中的细胞学（或生物化学）功能。靶基因是致死基因的ＶＩＧＳ和插入突变一样会引起植物的死亡，但其引起的死亡过程可能比插入突变引起的死亡提供更多的信息；而且可能通过靶序列的选择只引起基因的部分沉默，可得到存活的表型。ＶＩＧＳ技术和其它ＲＮＡｉ技术一样可以利用基因家族的同源性同时沉默家族中的多个基因，避免基因冗余对表型观察的影响。

因此，ＶＩＧＳ作为基因功能研究的重要技术，具有简单、快捷、高通量的特点。但分离鉴定可用于感兴趣的宿主植物的病毒比较困难，而且病毒的感染可能会影响对被沉默基因的表型观察（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅｔａｌ．，２００１）。２．２培育抗病毒作物

植物通过特异地降解病毒ＲＮＡ的方式沉默病毒基因而获得对病毒的抗性。有学者把植物的这些抗性称为植物的免疫。人们把植物病毒基因转入植物体内，病毒基因转录出的ＲＮＡ被宿主编码的ＲｄＲＰ识别并合成ｄｓＲＮＡ，进而引起后续的ＰＴＧＳ反

应，使植物获得对该种病毒的抗性。人们已经在多种

病毒诱导基因沉默（ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，植物中证明了ＲｄＲＰ的存在。也有实验表明，用反向ＶＩＧＳ）是用来分析植物基因功能的另一ＲＮＡｉ技术。重复序列转化植物，在植物中可直接表达出ｄｓＲＮＡ，在用ＶＩＧＳ技术研究基因功能时，人们将感兴趣的植并不需要植物体内ＲｄＲＰ的作用（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０００；物基因的一个外显子片段插入到病毒载体中，替代Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．，１９９８）。对病毒复制和移动非必需的基因，也可以作为一个无论病毒的基因组是ＲＮＡ还是ＤＮＡ，目前几额外的片段直接插入。用经过基因改造后的病毒感乎所有主要植物病毒都有通过ＲＮＡｉ技术获得抗性染植物后，插入片段会作为重组病毒的一部分在植的报道，如抗水稻矮缩病毒水稻（ＲＤＶ）（马中良等，物中复制并漫延。病毒复制过程中形成的双链ＲＮＡ２００４）、梅子脓泡病毒（ｐｌｕｍｐｏｘｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）（Ｇｕｏａｎｄ（ｄｓＲＮＡ）启动植物的ＲＮＡ介导的防御系统Ｇａｒｃｉａ，１９９７）、水稻黄斑病毒（ＲＹＭＶ）（Ｐｉｎｔｏｅｔａｌ．，（ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｆｅｎｓｅｓｙｓｔｅｍ，ＲＭＤ），随即引起和重１９９９）、马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．，组病毒序列相同的ｍＲＮＡ（即感兴趣的基因转录的１９９８）、烟草花叶病毒（ＴＭＶ）（赵明敏等，２００６）。ｍＲＮＡ）的降解（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｔａｌ．，２００４）。一般，从构建

２．３培育抗褐变的作物

病毒载体到感染植物后观察到植物的表型，只需要

苹果、梨、马铃薯等果蔬在生产、贮藏、加工过程９￣２３ｄ。遗传改造后的ＲＮＡ病毒基因组ｃＤＮＡ也可

导致巨大的经济损失。植物组以接上一个植物的启动子，然后直接感染植物中经常出现褐变现象，

（Ｓａｂｌｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９９５）或者利用根瘤农杆菌Ｔｉ质粒织的褐变和多酚氧化酶（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）有转化植物细胞（Ｔｕｒｐｅｎｅｔａｌ．，１９９３）。如果用病毒载体关，抑制ＰＰＯ活性可以减弱这些作物的褐变程度。

然后分析大量的被感染植物，Ｂａｃｈｅｍ等（１９９４）用反义ＲＮＡ技术抑制ＰＰＯ活性，构建一个ｃＤＮＡ文库，

那么ＶＩＧＳ技术也可以用于正向遗传学研究。

培育出抗褐变转基因马铃薯。Ｃｏｅｔｚｅｒ等（２００１）则同

ＲＮＡｉ技术及其在作物遗传育种中的应用

ＲＮＡｉａｎｄｉｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ

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时用反义ＲＮＡ技术和Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ技术来抑制ＰＰＯ活性，控制马铃薯的褐变。２００４年，曹艳红等利用ＩＲ－ＲＮＡｉ技术成功地干涉了苹果多酚氧化酶。

目前，我们实验构建了由胚乳特异启动子启动的小麦籽粒ＰＰＯ基因ＩＲ－ＲＮＡｉ载体（正义臂和反义臂之间插入了拟南芥ＦＡＤ２的ｉｎｔｒｏｎ９），并已成功转化小麦（Ｌｉａｎｇｅｔａｌ．，２００６），希望在不影响小麦的生

－ｚｅｉｎｓ的表达量（该蛋白亮氨酸含量很低）得到了高α

亮氨酸玉米突变体。之前的研究表明调控α－ｚｅｉｎｓ表达的转录因子ｏｐａｑｕｅ２的缺失会提高亮氨酸的含量，但这一缺失降低了玉米的品质和产量。Ｄａｖｕｌｕｒｉ等（２００５）利用一个果实特异启动子在番茄中沉默内源的光形态发生调控基因ＤＥＴ１，提高了类胡萝卜素

和类黄酮含量，但却不影响野生型的其他特性。番茄

长、抗逆性的前提下（不影响茎叶组织的ＰＰＯ合成），ＤＥＴ１基因的突变会导致ｈｉｇｈｐｉｇｍｅｎｔ－２（ｈｐ－２）表型。

而高水平的色素含量正是特异地抑制小麦籽粒中ＰＰＯ合成，从而减弱面粉及这一表型的色素含量很高，

类胡萝卜素和类黄酮含量提高的原因，但ＤＥＴ１基因其面食品在加工、贮藏中的褐变，提高面粉白度。２．４降低作物中有害物质的含量

一些作物中的某些物质对人类的健康有害，或对某些人群有不良反应。目前，人们已经用ＲＮＡｉ技术在几个作物中降低了某些有害物质的含量，为人

类提供更为健康、更为个性化的食品。例如在油炸加工过程时，多不饱和脂肪酸通过氢化作用生成反式脂肪酸，生成胆固醇，增加人体的心血管疾病发病几率。Ｌｉｕ等（２００２）利用反义ＲＮＡ和ＩＲ－ＲＮＡｉ技术以不饱和脂肪酸合成的２个关键基因ｇｈＳＡＤ－１和ｇｈ－ＦＡＤ２－１为目标分别转化棉花Ｃｏｋｅｒ３１５引起ＰＴＧＳ抑制目标基因，分别得到了高硬脂酸和高油酸的转化植株，然后利用两者杂交产生的Ｆ２分离群体得到了高硬脂酸和高油酸的棉花植株。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等（２００５ａ）用反义ＲＮＡ技术和ＩＲ－ＲＮＡｉ技术抑制亚麻苦苷和百脉根苷合成途径中的２个关键酶ＣＹＰ７９Ｄ１和ＣＹＰ７９Ｄ２的表达，得到的转基因木薯块茎中含氰苷含量降低９２％、叶子中氰含量低于野生型氰含量的１％。Ｏｇｉｔａ等（２００３）利用ＲＮＡｉ的方法对可可碱合成酶基因的表达进行抑制，使植株中的咖啡因含量比原来减少了７０％，为对咖啡因过敏的人群提供了低咖啡因咖啡。２．５提高作物的营养价值

用ＲＮＡｉ技术来提高作物中营养物质含量的例子并不多见，该类ＲＮＡｉ应用研究有赖于对作物新陈代谢时空调控更为细致的认识。

Ｋｉｎｎｅｙ（１９９６）利用正义—共抑制（ｓｅｎｓｅＲＡＮｉ）技术，降低△１２脂肪酸脱氢酶的活性，从后代中选育出油酸超过８０％的转基因大豆。Ｓｔｏｕｊｅｓｄｉｊｋ等（２００２）也用该技术将△１２脂肪酸脱氢酶基因沉默，从而使甘蓝型油菜和芥菜型油菜中的油酸含量分别升高到８９％和７５％。

Ｓｅｇａｌ等（２００３）用ＲＮＡｉ技术下调玉米贮藏蛋白

的缺失突变同样会影响番茄的产量和其它品质。２．６增加工业加工原料在作物中的含量

农业为工业提供大量的原材料，因此如何提高

工业加工原料在作物中的含量，降低原料纯化的成本，是作物遗传育种要解决的一个重要问题。利用ＲＮＡｉ技术改变代谢的物质流方向，通过抑制作物中其它成分的合成来提高工业加工原料在作物中的含量，无疑是一种十分有效的方法。

直链淀粉是重要的工业原料，在轻工业（可降解薄膜、工业酒精、胶卷和粘合剂等）、食品加工业和制药业等领域有广阔的应用前景。玉米目前是我国最主要的工业加工作物之一，其籽粒的淀粉含量为７０％￣７５％，但普通玉米的直链淀粉只占总淀粉含量

高直链玉米淀粉是指直链淀粉含量在总淀粉的１／４。

含量的５０％以上的玉米淀粉，只有高直链玉米淀粉

才具有商业开发价值。玉米的支链淀粉由ＳＢＥⅡａ、ＳＢＥⅡｂ和ＳＢＥⅠ３种淀粉分支酶催化合成，其中ＳＢＥⅡａ主要存在于叶片中，而ＳＢＥⅡｂ和ＳＢＥⅠ主要催化胚乳的支链淀粉合成。柴晓杰等（２００５）在３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子之间加入ｓｂｅⅡｂ基因片段的反向重复序列，然后用花粉管导入法转化玉米，最后得到淀粉分支酶活性降低约８５％、直链淀粉含量提高到约５０％的玉米植株。

目前，我们实验室用基因ｓｂｅⅡｂ和ｓｂｅⅠ的末端编码区（约２００ｂｐ）、３＇末端非编码区（３＇－ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ

用基ｒｅｇｉｏｎ，３＇－ＵＴＲ）构建了２个Ｓｅｎｓｅ－ＲＮＡｉ载体，希望得到因枪同时或分别转化玉米（Ｌｕｅｔａｌ．，２００６），

高拷贝的转基因玉米，通过筛选后代植株得到稳定遗传的高直链淀粉玉米。此外，我们还构建了这２个基因的ｈｐＲＮＡｉ表达载体（Ｇｕｏｅｔａｌ．，２００６）。

３ＲＮＡｉ技术展望

ＲＮＡｉ技术是一项抑制基因表达的技术，作用的

８８

分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

目标只能是作物原有的基因而不能引入新的基因，致谢因此要利用ＲＮＡｉ技术提高作物的品质必须对植物

本研究由国家自然科学基金（３０５００３２１，３０２７０８

组织代谢网络和时空调控有深入的了解并据此设计

３２）、北京市农林科学院青年科研基金项目（２００６－１５）

巧妙的实验方案。

资助。

在作物中，人们收获的部分（一般是种子）和作物生长所需部分的组织是不同的，组成性的基因改造可以改进种子的品质却往往不利于植物其它器官的生长，因此在进行基因工程作物育种中，基因的时空调控十分重要。虽然利用组织特异的或可诱导的启但是ＲＮＡｉ现象可动子可以调控ＲＮＡｉ的时空表达，

以在植株内系统蔓延（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．，２００１；Ｋｌａｈｒｅ所以当ＲＮＡｉ现象在一个特定的组织中ｅｔａｌ．，２００２），

表达时，ＲＮＡｉ现象也可能出现在其它并不希望出现的组织中。利用抑制ＰＴＧＳ信号系统性蔓延的病毒蛋白或者突变植物中和ＲＮＡｉ信号蔓延相关的基因也许可以决定这个问题。Ｃｈｅｎ等（２００３）也报道了一种乙醇诱导的体系没有ＲＮＡｉ信号蔓延的现象。

ＲＮＡｉ的作用位点要经过精心选择。位点选择不当还常常会导致脱靶效应（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔ）。由于ｓｉＲＮＡｓ和目标ｍＲＮＡ可以有一定的错配和间隙，因此ｓｉＲＮＡｓ可能在一个基因组中作用于上百个潜在

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因为ＲＮＡｉ和物化诱变、插入突变相比有其独特的优势，而植物存在多基因家族或多倍体现象，所以ＲＮＡｉ技术在作物遗传育种中可以敲除不良基因，创造新变异、新基因型。ＲＮＡｉ技术已经应用于作物遗传育种中多个方面，但是如何将ＲＮＡｉ技术更为广泛地应用于作物遗传育种中还需要进一步的研究。

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ＲＮＡｉ技术及其在作物遗传育种中的应用

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