星点设计―效应面法优选制巴戟天炮制工艺

　　摘要：目的 优选制巴戟天的最佳炮制工艺。方法 以巴戟肉为原料，通过单因素试验，选取加甘草汁量、煮制时间、闷润时间为自变量，以甲基异茜草素-1-甲醚、耐斯糖、水晶兰苷、甘草苷、甘草酸含量的综合评分为因变量，采用星点设计-效应面法优选制巴戟天最佳炮制工艺。结果 制巴戟天的最佳炮制工艺为：加甘草汁量1.5倍，闷润时间4 h，煮制时间25 min。实际测量值与OD预测值的偏差为1.39%。结论 采用星点设计-效应面法优选的制巴戟天炮制工艺稳定可行且预测性良好，可为制巴戟天的规范化生产提供依据。

　　关键词：制巴戟天；星点设计-效应面法；炮制工艺

　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.020

　　中图分类号：R283.3 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0081-05

　　Optimization of Liqorice-Processing Technology of Morinda officinalis How by Central Composite Design-Reponse Surface Methodology SHI Ji1，2，3， HUANG Yu-qiu1， GENG Tong-tong1， FAN Ya-nan1， JIA Tian-zhu1，2，3 （1. College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 2.Key Laboratory of Processing Principle Analysis， State Administration of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 3. Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for TCM， Dalian 116600， China）

　　Abstract： Objective To optimize the licorice-processing technology of Morinda officinalis How. Methods Morinda officinalis How was selected as raw materials. Single-factor experiment was used to select licorice-juice amount， boiling time and moistening time as independent variables， the comprehensive scores of contents of rubiadin-1-methylether， nystose， monotropein， liquiritin， glycyrrhizinate as the dependent variables. The central composite design and response surface methodology was employed to optimize processing technology of Morinda officinalis How. Results The optimized processing parameters consisted of 1.5 times the amount of licorice juice， moistening 4 h， boiling 25 min. The deviation between real measured value and predicted value of OD was 1.39%. Conclusion The central composite design and response surface methodology for optimizing licorice-processing technology of Morinda officinalis How is stable， feasible and highly predictable， which can provide references for standardizing production of Morinda officinalis How.

　　Key words： Morinda officinalis How； central composite design and response surface methodology； processing technology

　　巴戟天系茜草科巴戟属多年生攀援木质藤本植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，为著名的“四大南药”之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效[1]，临床用于治疗阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、少腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软等症。巴戟天主要含茜草素型蒽醌、环烯醚萜苷、寡糖等化学成分[2-3]。

　　基金项目：国家自然科学基金（81473350）；国家自然科学基金青年基金（81001635）

　　通讯作者：贾天柱，E-mail：[email protected]

　　2015年版《中华人民共和国药典》收载巴戟天的炮制品种有巴戟天、巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天。本课题组前期研究结果表明，巴戟天炮制后化学成分发生较大改变，其中甘草制后茜草素型蒽醌含量增加最明显，环烯醚萜苷和寡糖含量也有所增加；药理实验表明甘草汁制巴戟天的脾肾双补作用表现突出[4-5]。这与古文献记载是一致的。我们通过临床调研和饮片厂走访发现，目前临床广泛使用的巴戟天炮制品种为盐巴戟天，药店或药材集散地出售的制巴戟天也多为盐巴戟天，而不是甘草汁制巴戟天。因此，制巴戟天的炮制工艺急需规范化，并明确其药理作用及临床应用。基于此，本研究在单因素考察的基础上，以巴戟天中的活性成分甲基异茜草素-1-甲醚、水晶兰苷、耐斯糖及甘草中的甘草苷和甘草酸含量为指标，采用星点设计-效应面法全面优化制巴戟天的炮制工艺参数，为制巴戟天的质量控制、规范化生产以及临床应用提供依据。 　　1 仪器与试药

　　LC-20A型高效液相色谱仪（SPD-M20A型检测器，日本岛津公司），E2695-2998型高效液相色谱仪（美国Waters公司），FA1004电子天平（上海精密科学仪器有限公司），AE240型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

　　巴戟天药材购于安徽亳州药材市场，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。甘草购自大连海王星辰大药房，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根。水晶兰苷对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-11062204，纯度≥98.0%），耐斯糖对照品（日本Wako公司，批号292-64121，纯度≥99.0%），甲基异茜草素-1-甲醚（本实验室自制，纯度>95%），食盐（延吉高丽亚食品经销部），乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

　　2 方法和结果

　　2.1 样品的制备

　　巴戟肉：巴戟天加1.0倍量水，50 ℃下闷润9 h，去除木心，切段10～15 mm。

　　制巴戟天：取甘草6 g，加水煎煮3次，每次1.5 h，合并煎煮液，浓缩至150 mL，即为甘草汁。取定量甘草汁，加入巴戟肉，闷润一定时间后，煎煮至甘草汁吸尽，即得。

　　2.2 甲基异茜草素-1-甲醚含量测定

　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取甲基异茜草素-1-甲醚对照品2.93 mg于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液，备用。

　　2.2.2 色谱条件 参照文献[4，6]，选用Ecosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈- 0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱（20∶80→42∶58，15 min；60∶40→95∶5，5 min），流速为1.0 mL/min，检测波长为277 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 ?L。色谱图见图1。

　　2.2.3 供试品溶液的制备 称取不同炮制方法制备的制巴戟天粉末（过60目筛），精密称定2 g，置于100 mL圆底烧瓶中，再加入氯仿80 mL，回流提取2次，每次2 h，合并滤液，回收氯仿，残渣以甲醇定容至10 mL容量瓶中，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

　　2.3 耐斯糖含量测定

　　2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取128 mg耐斯糖，以甲醇-水（3∶97）定容至500 mL容量瓶中，摇匀，即得。

　　2.3.2 色谱条件 参照文献[5，7]，选用Ecosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇-水（3∶97），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为5 ?L。色谱图见图2。

　　2.3.3 供试品溶液的制备 取不同炮制方法制备的制巴戟天粉末（过60目筛）0.5 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，过滤，弃去滤液，挥干后，滤渣再加70%乙醇50 mL，离心，上清液旋干，用甲醇-水（3∶97）定容至25 mL量瓶中，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

　　2.4 水晶兰苷含量测定

　　2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取15.8 mg水晶兰苷对照品，用80%甲醇定容至50 mL容量瓶中，摇匀，即得。

　　2.4.2 色谱条件 参照文献[5]，选用Venusil MP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇- 0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（5∶95→28.8∶71.2，15 min），检测波长为235 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为2 ?L。色谱图见图3。

　　2.4.3 供试品溶液的制备 取不同炮制方法制备的制巴戟天粉末（过60目筛）1 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，加入80%甲醇100 mL，冷浸1 h，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，过滤，回收甲醇，并用80%甲醇定容至10 mL容量瓶，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

　　2.5 甘草苷和甘草酸含量测定

　　2.5.1 对照品溶液的制备 分别精密称取甘草苷和甘草酸对照品6.8 mg和10.6 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

　　2.5.2 色谱条件 参照文献[8]，选用Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈- 0.05%磷酸水，梯度洗脱（0～8 min，19%乙腈；8～38 min，19%～50%乙腈；38～40 min，100%乙腈），流速为1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长为254 nm，进样量为10 ?L。

　　2.5.3 供试品溶液的制备 取样品粉末3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

　　2.6 单因素考察

　　2.6.1 甘草汁的量 取巴戟肉5份各30 g，分别加入0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5倍量的甘草汁，闷润5 h，蒸2 h后干燥。按上述方法测定各指标性成分含量，计算综合评分OD值，通过对甘草汁不同加入量进行评价，得出甘草汁为1.5倍量时最好。

　　2.6.2 闷润时间 取巴戟肉5份各30 g，加1.5倍量甘草汁，分别闷润0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h，蒸2 h，按上述方法测定各指标性成分含量，计算综合评分OD值，通过对不同的闷润时间进行评价，得出闷润时间为4 h时最好。 　　2.6.3 蒸制、煮制 取巴戟肉5份各30 g，加1.5倍量甘草汁，分别蒸制0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，其余5份分别煮制7、13、25、45、90 min，均闷润4 h并干燥，测定各指标性成分含量，求出综合评分OD值，对不同的蒸制和煮制时间进行评价，可得出煮制方法更好，并且煮制25 min最好。

　　2.7 星点设计-效应面法优化工艺

　　2.7.1 星点设计 依据星点设计的原理，在单因素试验的基础上选择加甘草汁的量（A，倍）、闷润时间（B，h）、煮制时间（C，min）为考察因素，每个因素选择5个水平，用甲基异茜草素-1-甲醚含量、耐斯糖含量、水晶兰苷含量、甘草苷和甘草酸含量的加权综合评分OD值为指标，优选制巴戟天的炮制工艺。OD值=0.3×耐斯糖含量+0.3×甲基异茜草素-1-甲醚含量+0.3×水晶兰苷含量+0.05×甘草酸含量+0.05×甘草苷含量。因素水平和编码见表1，试验安排和结果见表2。

　　2.7.2 拟合模型 以OD值为因变量，并依据试验结果，使用Design-Expert8.0.6.1软件对各自变量进行回归分析，得回归方程：Y=-1.190 20+0.976 1A+0.422 7B+0.035 9C-0.015 6AB+0.003 194AC+0.001 247BC-0.318 9A2-0.058 9B2-0.000 795 1C2 （r=0.967 8，P=0.000 3）。相关系数r越大，模型的拟合度越高，预测性越好。由方差分析可见，A因素（加甘草汁量）及C因素（煮制时间）对OD值影响显著（P　　2.7.3 效应面的优化和预测评价 根据回归方程，应用Design-Expert8.0.6.1软件绘制影响较为显著的2个因素和OD值的三维效应面以确定最佳的工艺区域，筛选出最佳工艺，见图4。

　　在A和B因素中，随着A（加甘草汁量）的增加曲面变得陡峭，B（闷润时间）则对曲面的影响较小，随着B闷润时间的变化曲面较为平滑；在A和C因素中，随A、C的增加，OD值也在不断增加，直到达到最大值；B、C因素和A、C因素对OD值的影响比较相似。因此可以得出，B的影响较小而A、C的影响较为显著。

　　2.7.4 验证试验 根据生产实际并结合Design- Expert8.0.6.1软件的计算，得出制巴戟天的最佳炮制工艺为：加甘草汁量1.5倍，闷润4 h，煮制25 min（每100 g巴戟肉用甘草6 g）。按照筛选出的最佳炮制工艺条件重复3次，得出平均实际测量值0.814 5，与理论预测值0.816之间的相对误差[（预测值-实际值）÷预测值]　　3 讨论

　　巴戟天经甘草汁煮制后，脾肾双补作用增强。本课题组前期研究表明，甘草汁制巴戟天有利于多糖成分的溶出，总蒽醌和游离蒽醌的含量均增加[9-10]，水晶兰苷及寡糖的含量也有所增加[5-6]，故本课题选取耐斯糖、水晶兰苷、甲基异茜草素-1-甲醚以及甘草中的甘草酸和甘草苷为指标，对制巴戟天的炮制工艺进行优化，以评价制巴戟天的饮片质量，保证其药效。本试验选择星点设计-效应面法，运用非线性数学模型对此模型进行拟合，对其工艺进行优化，可以直接看出最佳的效应区域。验证试验表明，所得出的最佳的工艺条件稳定，精密度和重现性都较好。使用星点设计-效应面法对制巴戟天进行工艺条件选择比常用的正交设计更加直观形象，方法是有效、可行的，具有实际应用的价值。

　　参考文献：

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　　（收稿日期：2015-12-03）

　　（修回日期：2015-12-23；编辑：陈静）