液_质联用研究红豆杉提取物中紫杉烷类化合物
第33卷
分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告第3期
2005年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry333～337
液2质联用研究红豆杉提取物中紫杉烷类化合物
李 明 陈建民
1
2
1
31
陈家宽
2
(复旦大学环境科学与工程系,复旦大学天然药物研究中心,上海200433)
(复旦大学生命科学学院生物多样性科学研究所,生物多样性与生态工程教育部重点实验室,上海200433)
摘 要 建立了一套利用反相高效液相色谱和大气压化学电离质谱联用技术分析红豆杉提取物中微量紫杉烷类化合物的方法。通过研究已知的10种紫杉烷类化合物的保留时间、质谱特征,化合物的数据库,,一定程度的结构分析。。关键词 紫杉醇,大气压化学电离质谱,1 引 言
[1]
紫杉醇(图1(Taxusbrevifolia)茎皮中分离得到的一种二萜类化合物,用于
。然而紫杉醇资源有限,极大的限制了它的临床应用。在紫杉烷类化
[3]
合物中,许多物质都有抗肿瘤活性,还有一些可以通过结构改
[4]
造合成紫杉醇甚至药效更好的化合物。无论是研究红豆杉提取物中的紫杉烷类化合物还是结构改造中的中间产物,都需要高效而灵敏的分离鉴定手段。高效液相色谱较早被用于紫杉烷类
化合物的分离和紫杉醇的定量分析,质谱也被广泛的应用于
[9～15]
紫杉烷类化合物的分析鉴定。实验研究了紫杉烷类化合物的正离子大气压化学电离质谱,找到了这些物质的质谱特征,并建立了利用反相高效液相色谱和大气压化学电离质谱联用技术
图1 紫杉烷类化合物一般的分子结构研究红豆杉提取物中微量的紫杉烷类化合物的方法。
[5～8]
[]
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
LCQAdvantage质谱仪(美国ThermoFinnigan公司)。乙腈为HPLC纯;水由法国Millipore公司的Milli2Q水纯化系统制备;甲
和质谱解离方式,对紫杉醇而言,R1=
C6H5,R2=CH3CO,R3=OH
Fig.1 Generaltaxanestructureandschemeofmassspectralfragmentation,forpaclitaxel,R1=C6H5,R2=CH3CO,R3=OH
醇、氯仿、正己烷、乙酸乙酯为分析纯;柱层析用硅胶(上海五四化
学试剂有限公司,75～150μm)。巴卡亭Ⅲ、102去乙酰基巴卡亭
Ⅲ、紫杉醇、102去乙酰基27表紫杉醇、三尖杉宁碱、102去乙酰基27表三尖杉宁碱、102去乙酰基27木糖基三尖杉宁碱、102去乙酰基27木糖基紫杉醇、102去乙酰基272木糖基紫杉醇C、72表紫杉醇由本实验室制备,并经核磁共振检测确认。质谱条件:全范围扫描100～1000;壳气(N2):65单位,辅助气(N2):20单位;放电电流5μA;蒸发器温度465℃,毛细管温度180℃。色谱条件:MetaChem公司的Taxsil23柱(250mm×4.6mm);流动相:乙腈∶水(49∶51),流速:0.8mL/min,柱温:35℃。2.2 样品的处理
取干燥的南方红豆杉(Taxusmairei)树皮1kg,粉碎至小于250μm,用甲醇浸提3次(5L×3),每次10h,浓缩浸提液,用正己烷萃取3次(2L×3),正己烷层舍弃,然后用氯仿和水萃取3次(2L×3),氯仿层浓缩干燥,上硅胶柱,以乙酸乙酯∶正己烷(1∶1)为流动相淋洗,收集相应的馏分,旋转蒸发得到。
2004203209收稿;2004211208接受
本文系国家自然科学基金(No.20377008)和国家教育部归国留学人员基金资助
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分析化学第33卷
3 结果与讨论
3.1 已知的紫杉烷类化合物的分析
通过分析已有的紫杉烷类化合物可以初步建立一个有关紫杉烷类化合物的数据库,从而可以快速方便的分析红豆杉提取物、中间产物。表1列出用10种常见的紫杉烷类化合物的分子结构信息、分子量和相对保留时间。利用液相色谱在上述条件下分析这些紫杉烷类化合物,得到各个化合物的相对保留时间,即这些化合物的色谱特征数据,从而便于实验室之间数据的比较对照。利用化合物在反相色谱中保留时间的长短还可以大致衡量其亲脂性强弱,有助于是解释未知紫杉烷类化合物结构。
表1 10种紫杉烷类化合物的结构信息和相对保留时间Table1 StructureandRetentionTime(RT)oftentaxanes
化合物
Compound
102乙酰基巴卡亭Ⅲ102DeacetylbaccatinⅢ102去乙酰基272木糖基三尖杉宁碱102Deacetyl272xylosyl2cephalomannine
编号
No.
0.410.430.450.550.830.900.9411.32
[***********][1**********]3
1-C4H7-C6H5C5H11C4H7C4H7C6H5C6H5C6H5
R23HHCH3COHHHCH3COHCH3COCH3CO
R33OH
ⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩ
β2Xylose
OH
巴卡亭ⅢBaccatinⅢ
102去乙酰基272木102Deacetyl272xylosyl2102去乙酰基272木C102Deacetyl272xylosyl2taxolC102去乙酰基272表三尖杉宁碱102Deacetyl272epi2cephalomannine三尖杉宁碱Cephalomannine102去乙酰基272表紫杉醇102Deacetyl272epi2taxol紫杉醇Taxol72表紫杉醇72epi2Taxol
β2Xyloseβ2Xyloseβ2OH
OH
β2OH
OH
β2OH
3各个取代基的位置请参考图1(showninFig.1forthepositionofR)
在液2质联用中通过质谱分析可以获得相关化合物分子量以及与结构相关的碎片离子的信息,结合液相分析得到的化合物亲脂性的信息,可以快速对化合物进行结构鉴定。表2是10种化合物的离子碎片离子,图1说明了这些碎片离子的产生方式。这些化合物的质谱有许多共性,所有这些化合物都有
表2 紫杉烷类化合物的质谱碎片离子Table2 Positiveatmospherepressurechemicalionization(APCI)productionspectraoftentaxanes
化合物3
Compound[M+H]+
A-659-[***********]569
B-641-[***********]551
C------491-491-D509-509---509-509509
E387-387---[1**********]7
碎片离子Fragmentpeak
F327-327-----327327
G------710-732-H--------447447
I-246-268262-[1**********]8
J---[**************]-240
K-264-286280264-286286286
L[**************]-772-794794
M-----[**************]
N-[1**********]8-[1**********]5
其他
Others405 345527 509405 345509 527527 [1**********]2 544672-
Ⅰ
ⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩ
[***********][1**********]4
3各个化合物名称请参考表1(showninTable1forcompoundnames)
与紫杉醇相同的母环结构,最后都会生成m/z=509的母环特征离子;由于母环上取代基不同,各个化合物还会生成许多特征的离子,主要包括以下3类:第一类是关于13位上侧链的特征离子,许多化合物的侧链和紫杉醇的(m/z=286)相似,仅仅是氨基所连的官能团(R1)有所差别。这可以根据侧链离子的荷质比加以判断,比如102去乙酰基272木糖基紫杉醇C以戊烷基代替了紫杉醇的苯基,所以它侧链的特征离子m/z=280,比紫杉醇小了6;其次如三尖杉宁碱类的侧链,氨基上连一个22丁烯基,所以m/z=264;
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还有一些在13位没有连大分子的基团,就不会有相应的特征离子,如102乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ,
它们13位都是羟基,所以没有相应的碎片离子。第二类是关于10位上所连的基团的,由于10位的基团脱去后可以与11位的双键形成能量较低的稳定共振结构,所以10位上的基团很容易脱去形成相应的中性碎片丢失,如果10位连的是乙酰基,准分子离子就很容易形成60的中性碎片丢失,如果连的是羟基,则易形成18的中性碎片丢失。第三类是关于7位的,许多化合物在7位有相同的官能团,只是键的空间位置不同,这些化合物的质谱基本上是一样的。考虑到大部分的紫杉烷类化合物拥有与紫杉醇相似的结构,特别是有与紫杉醇一样的母环结构,所以这些物质会和紫杉醇及其他的标准紫杉烷类化合物经历相似的裂解途径。相同的特征离子和中性分子丢失,说明含有相同的结构,相对应的不同离子则说明了结构上的差异。因此,用APCI/MS3.2 液2质联用分析红豆杉提取物3.2.1 未知化合物分子量的确定 图2UV图(227nm)和质谱总离子流图。这两幅图有很大的一致性,,为质谱分析创造了良好的条件。,,可以凭借质谱的质量分析能力进行分析(3,但还是可以判断保留时间为14.18min
图2 紫杉醇提取过程中间产物的色谱图(a)和总离子流色谱图(b)
Fig.2 HighperformanceliquidchromatogramsofaprocessintermediatesamplefromtheisolationofTaxol:(a)liquidchromatogrpahy(LC)/ultravioletprofilechromatogram(227nm),(b)LC/massspectral(MS)profiletotalioncurrentchromatogram
图3 中间产物中保留时间为14.18min的三尖杉宁碱(分子量831)的全范围扫描质谱图
Fig.3 Full2scanmassspectrumofcephalomannine(molwt831)atretentiontime(RT)14.18minintheprocessintermediatesample
3.2.2 提取物中紫杉烷类化合物的初步分析 迄今为止,已经发现了300多种紫杉烷类化合物
[16]
。
由这些化合物的结构式可以知道其分子量,利用质谱的选择离子扫描可以初步判断某一混合物中是否含有这些化合物,然后再根据质谱的图谱加以确认。图4是利用选择离子扫描方式分析上述中间产物而发现的一些可能的紫杉烷类化合物的色谱图。对于还未被发现的新化合物也可以根据质谱图,对其结构做一些判断。例如,根据化合物是否形成m/z=509的母环特征离子可以判断该化合物是否有和紫杉醇一样的母环。
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3.2.3 未知化合物的质谱分析 因为许多紫杉烷类化合物有相似结构,相近裂解途径,故用APCI/MS
可以做这类化合物的精细结构解析。以图4中出峰时间为7.21min的未知化合物为例,说明用质谱分析化合物结构的方法。图5显示了该化合物的大气压化学电离质谱,对照图6的紫杉醇的质谱图:它的侧链形成m/z=268.1的离子,其母环在脱侧链之后该化合物形成了m/z509.1和527.1的离子,说明该化合物的侧链与紫杉醇一样,而母环含有与102去乙酰基272表-紫杉醇相似的结构;准分子离子峰的m/z943.9,比102去乙酰基2紫杉醇大132.1,同时在该物质的图谱中有准分子离子峰脱去149.9得到的m/z=794.0的离子峰;而且该物质在色谱中的出峰时间(7.min)比紫杉醇(15.92min)早,弱;综合这3项,物的资料,个木糖基,可能是2紫杉醇。3.3 结论
本实验利用液相色谱-大气压化学电离质谱联用研究紫杉烷类化合物标准样品,得到这些化合物的液相色谱保留时间、质谱特征图谱以及质谱裂解规律等信息,
据此可以
图4 图2所示中间产物中可能包含的一些紫杉烷类化合物的荷氢离子选择离子色谱图
Fig.4 LC/MSmasschromatograms(extractedioncurrentprofiles)ofsomepossibletaxanesatthem/zratiooftheir[M+H]
+
ions,inthe
processintermediatesampleshowninfig.2
图5保留时间7.21min的未知化合物的全范围扫描质谱图及其解释
Fig.5 Full2scanmassspectrumofunknownatRT7.21minanditsexplanati
on
图6 紫杉醇的正离子大气压化学电离质谱及其解释
Fig.6 PositiveAPCImassspectraoftaxolanditsexplanation
建立一个有关紫杉烷类化合物的数据库,用于红豆杉的粗提物、纯化紫杉醇过程中的中间产物的分析,本实验所用的方法也适用于其他天然产物的开发和研究,特别适用于微量成分的分析。
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References
1 WaniMC,TaylorHL,WallME,CoggonP,McPhailAT.J.Am.Chem.Soc.,1971,93:2325～23272 RowinskyEk,CazenaveLA,DonehowerRC.J.Nat.Cancer.Inst.,1990,82:1247～12593 KingstonDI,SamaranayakeG,lveyCA.J.Nat.Prod.,1990,53:1～12
4 DenisJN,GreeneAE,GuenardD,FrancoiseGV,MangatalL,PotierP.J.Am.Chem.Soc.,1988,110(17):5917
～5919
5 WitherupKM,LookSA,StaskoMW,McCloudTG,IssaqHJ,MuschikGM.J.Liq.Chromatogr.,1989,12:2117
～2132
6 CardellinaJH.J.Liq.Chromatogr.,1991,14:659～665
7 HarveySD,CampbellJA,KelseyRG,VanceNC.J.Chromatogr.,1991,587:8 XueJ,ChenJM,ZhangL,BuHS.J.Liq.Chromtogr.&Rel..,,)～25129 AuriolaS,LepistoAM,NaaranlahtiT,LapinjokiSP.J.1992～158
10 MaWW,BitschF,MacdonaldF,NiederbM,.2Biomed.,1993,615:273～28011 KernsEH,VolkKJ,HillSE,LeeMS.Nat.Prod.,,1391～1403
12 HokeSH,CooksRG,ChangC,SJ,AlvaradoB,McguireMT,SnaderKM.J.Nat.Prod.,
1994,57:277～13 MadhusudananKSK,SahaGC,KulshresthaM,SharmaRP,KumarS.J.MassSpectrom.,1997,
32:216～224
14 TheodoridisG,LaskarisG,deJongCF,HofteAJP,VerpoorteR.J.Chromatogr.A,1998,802:297～30515 BaldreySF,BrodieRR,MorrisGR,JenkinsEH,BrookesST.Chromatogr.,2002,55:s187～s19216 BalogluE,KingstonDGI.J.Nat.Prod.,1999,62(10):1448～1472
ProfilingTaxanesinTaxusExtractionUsing
LiquidChromatography/MassSpectrometricTechnique
LiMing,ChenJianmin
1
2
1
31
,ChenJiakuan
2
(DepartmentofEnvironmentalScience&Engineering,FudanUniversity,Shanghai200433)
SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433)
(MinistryofEducationKeyLaboratoryforBiodiversityScienceandEcologicalEngineering,InstituteofBiodiversityScience,
Abstract Analyticalmethodwasdevelopedforthetraceanalysisoftaxanesincrudeextractionandidentifica2tionoftheantitumoragentpaclitaxel.Relatedtaxaneanalogueshavebeencarriedoutusingahighperfor2manceliquidchromatographic.Bothdiodearraydetectorandmassspectrometrywereincorporatedintothissystem,providingadditionalspectralandstructuralinformationfortheidentificationofunknownsamples.Standardtaxanesgaveexcellentpositive2ionatmospherepressurechemicalionization(APCI)spectrawithdominant[M+H]
+
ioninfull2scan.Fragmentalandstructurallyinformativespectrawereobtainedatthe
sametime.ThefragmentsfoundwerebothoftheC213side2chainandofthetaxanering,sotheanalysisgaveimportantinformationaboutthetaxanestructure,includinganychemicalmodificationatdifferentpositionsofthemolecular.Thedataobtainedfor10taxanesusingthismethodprovideataxaneprofiledatabaseusefulfortherapididentificationoftaxanes.
Keywords Paclitaxel,atmospherepressurechemicalionizationmassspectrometry,taxanes
(Received9March2004;accepted8November2004)