肝素琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的-

第5卷第5期 过 程 工 程 学 报 Vol.5 No.5 2005年 10 月 The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2005

肝素−琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用

穆成华

1,2

， 姚红娟， 马光辉， 连 宾

112

(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080； 2. 贵州大学化学与生物工程学院，贵州 贵阳 550003)

摘 要：以自制琼脂糖凝胶6FF为基质，肝素为配基，利用还原胺化方法制备了肝素−琼脂糖凝胶6FF介质. 考察了

肝素偶联反应的影响因素，并对其进行了优化，得到肝素配基的含量为2.7 mg/mL. 用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶III，从血浆开始计算的抗凝血酶III活性回收率为31.76%，与商品Heparin−Sepharose CL−6B的分离效果相当. 关键词：亲和层析；肝素；抗凝血酶III

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2005)05−0545−05

1 前 言

抗凝血酶III(AT−III)是一种含糖10%的单链α2糖蛋白，相对分子量为58~64 kD，由432个氨基酸组成，是人血浆中主要的生理性凝血酶抑制蛋白. AT−III制剂自1974年试用于临床以来，其疗效肯定，适应症日益增多，特别是预防和治疗肝肾疾病、弥漫性血管内凝血(DIC)等症[2]. 分离纯化AT−III的技术受到人们的普遍重视和关注. 但我国尝试从血浆中分离AT−III的工作很少，无自己的专利，至今没有AT−III制剂在国内上市. 因此发展我国自己的AT−III制备技术迫在眉睫.

综观AT−III的分离纯化历史，除了最初采用氢氧化铝、磷酸钙吸附、离子交换层析等制备方法外，自1970年以来，AT−III的制备方法中都至少用了一次肝素亲和层析[3−6]，缩短了流程，提高了收率和纯度. 因而在AT−III的分离纯化过程中，肝素亲和层析是关键步骤. 目前在国内此类亲和介质主要依靠进口，价格昂贵(300 元/g). 制备方法保密，使AT−III分离纯化的成本很高，难以实现产业化. 因此，研究制备肝素亲和层析介质具有重要意义. 肝素亲和层析介质的制备方法一般包括载体的活化和偶联两个步骤. 姜世明等[7]利用Pharmacia公司的Sepharose 4B为基质，采用环氧氯丙烷活化，然后将其直接与肝素偶联，制得肝素−琼脂糖凝胶. 本研究采用另一种偶联方式，即环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶经过胺化过程后，利用还原胺化反应，胺化后的介质与肝素的末端醛基反应，能确保其他基团的完整性，而不影响肝素的亲和活性. 另外，本研究采用自制的琼脂糖凝胶6FF介质，这种基质交联度比较高，具有很好的机械强度，可在高流速条件下使用. 将肝素(Heparin)作为配基偶联到实验室自制的琼脂糖凝胶6FF上，在得到肝

[1]

素−琼脂糖凝胶6FF介质后，将其用于人血浆中AT−III的分离纯化，得到了与进口介质相当的分离效果，说明用这种方法制备的介质与AT−III等生物活性分子之间具有良好的亲和活性，为系列琼脂糖凝胶介质的国产化奠定了基础.

2 实 验

2.1 仪器与试剂

层析工作站ÄKTA Purifier 购自瑞典Pharmacia公司，琼脂糖凝胶6FF为国家生化工程技术研究中心(北京)的产品，；Heparin−Sepharose CL−6B 购自Pharmacia公司，肝素钠(Mw=8000∼25000，效价大于160 IU/mg)购自常州千红生化制药有限公司，原料血浆由北京生物制品研究所供给. 2.2 实验方法

2.2.1

肝素−琼脂糖凝胶6FF的制备

肝素−琼脂糖凝胶6FF制备的工艺路线如图1所示. 以本实验室自制的琼脂糖凝胶6FF为基质，用环氧氯丙烷进行活化，活化方法参考Matsumoto等[8]的方法，得到环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶6FF；再加入浓氨水反

H H2

HO

HHH2H2.NH3H2O

OHep

OH

HH2H

Hep

图1 肝素−琼脂糖凝胶6FF的合成路线

Fig.1 Preparation of heparin−agarose 6FF

收稿日期：2004−11−18，修回日期：2005−01−13

基金项目：国家863高技术计划资助项目(编号：2004AA625040)

作者简介：穆成华(1971−)，男，山东省德州市人，硕士研究生，生物化工专业；马光辉，通讯联系人，Tel: 010-82627072, E-mail: [email protected].

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应，得到胺基琼脂糖凝胶6FF；然后利用还原胺化反应与肝素还原端的醛基偶联，得到肝素−琼脂糖凝胶6FF.

依据肝素多糖分子上含有羧基(⎯COOH)，采用酸碱电位滴定方法测定肝素−琼脂糖凝胶上肝素含量[9]. 2.2.2 AT−III的亲和层析纯化

(1) 血浆预处理

新鲜冷冻人血浆在4℃融化后，取20 mL离心去除冷沉淀，用1 mol/L柠檬酸钠(或柠檬酸)将冷上清液的pH调到7.4，边搅拌边缓慢加入150 g/L PEG4000. 离心(10000 r/min, 30 min)，取上清液，加入200 g/L PEG，其余操作同上. 弃去上清液，沉淀用适量亲和层析平衡液溶解，然后用0.45 μm的滤膜过滤，平均分装为2份备用.

(2) 分离纯化AT−III[10]

在4℃的层析冷柜中，将亲和层析介质装柱，以Buffer 1平衡柱体；将上述预处理后的血浆样品上样，然后用Buffer 1充分洗涤柱体；接着用Buffer 2淋洗柱体至OD280

Buffer 1：pH 7.2, 0.15 mol/L NaCl和0.01 mol/L柠檬酸钠的0.05 mol/L Tris−HCl缓冲液；

Buffer 2：pH 7.2, 0.50 mol/L NaCl和0.01 mol/L柠檬酸钠的0.05 mol/L Tris−HCl缓冲液;

Buffer 3：pH 7.2, 2.0 mol/L NaCl和0.01 mol/L柠檬酸钠的0.05 mol/L Tris−HCl缓冲液. 2.2.3 AT−III产品的分析检测

(1) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

按Laemmli[11]方法进行电泳. 浓缩胶浓度为4%，其缓冲液为0.5 mol/L Tris−HCl缓冲液(pH 6.8)；分离胶

浓度为12%，其缓冲液为1.5 mol/L Tris−HCl缓冲液(pH )

g50

/l om45(μ s p40uorg35 onim30a fo25 tnet20n oC15

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Amount of concentrated ammonia solution (mL/g)

图2 浓氨水用量对胺基密度的影响 Fig.2 Effect of the amount of concentrated ammonia solution on the content of amino groups

8.8). 运行环境电压120 V，电流80 mA. 采用银染法[12]进行染色.

(2) 微量发色底物法测定AT−III的活性

采用微量发色三肽底物法测定AT−III的生物活性，根据龚道元等[13]的方法并加以改良. 在样品中加入适量肝素和过量牛凝血酶，然后再加入发色底物S131450，剩余凝血酶裂解底物释放出显色基团对硝基苯胺(PNA)，其显色程度与AT−III的活性呈负相关，从而测定AT−III的活性.

3 结果和讨论

3.1 肝素−琼脂糖凝胶6FF的合成 3.1.1 环氧活化过程

经过对氢氧化钠浓度、环氧氯丙烷浓度、反应时间、反应温度等因素的考察，优化结果为：100 mL琼脂糖凝胶6FF中加入环氧氯丙烷100 mL，3 mol/L NaOH溶液80 mL，反应温度60℃，反应时间8 h. 所得环氧活化的琼脂糖凝胶的环氧基团密度为54.28 μmol/g(湿胶，下同). 3.1.2 胺化过程

对环氧活化的琼脂糖凝胶胺化过程的影响因素浓氨水(含量25%∼28%)用量、反应时间、反应温度进行了详细考察，结果如图2∼4所示. 结果表明，胺基密度随浓氨水加入量、反应时间的增加而增大. 在温度较低时，胺基密度随反应温度的升高而增大；当反应温度达到40℃后，再升高温度，胺基密度略有下降. 因为温度过高有利于琼脂糖交联反应等副反应的进行.

最后，得到的优化条件是：1 g抽干胶加入浓氨水1 mL，反应温度40℃，反应时间大于3 h. 在此条件下，得到的湿胶胺基密度为52.64 μmol/g，表明琼脂糖凝胶

上的环氧基已基本上转化为胺基.

)

g55

/lom(μ sp50

uorg onim45

a fo tnet40

noC1

2

345678

Reaction time (h)

图3 反应时间对胺基密度的影响

Fig.3 Effect of reaction time on the content of amino groups

第5期 穆成华等：肝素−琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用 547

)

g45

/lo

(μm s puorg 40

oni ma35

fo tnet oC 30

2030405060

Temperature (℃)

图4 反应温度对胺基密度的影响

Fig.4 Effect of temperature on the content of amino groups

3.1.3 偶联过程

考察了将肝素偶联到胺基琼脂糖凝胶上的过程中肝素浓度和反应时间对肝素密度的影响.

图5是不同的肝素加入量对肝素密度的影响. 从图可以看出，在肝素浓度较低时，偶联到琼脂糖凝胶上的肝素密度随肝素加入量的增加而近似直线增加；当肝素浓度达到一定值后，肝素密度随肝素加入量的增加而变化不大. 起始反应混合物中肝素浓度达到30 mg/mL时，肝素密度为4.4 mg/g，基本达到饱和.

)

g 5.0/gm

4.5

( 4.0

de z3.5

ilibo 3.0mm i2.5 nira 2.0pe 1.5H 1.0

5

10

15

20

25

30

3540

45

Heparin concentration (mg/mL)

图5 肝素加入量对肝素密度的影响

Fig.5 The influence of heparin concentration on the ligand

density of heparin

图6是琼脂糖凝胶上的肝素密度随反应时间的变化曲线. 从图可以看出，48 h后反应达到平衡，再延长反应时间对提高肝素密度的作用不大. 一方面由于空间位阻作用，并不是所有的琼脂糖凝胶上的胺基都能够被偶联上肝素基团；另一方面，偶联反应仅发生在肝素还原末端的醛基，而醛基数量有限，因而反应到一定程度后，反应基本平衡.

通过对胺基琼脂糖凝胶偶联过程的影响因素的考察，得到反应的最佳条件为：反应时间48 h，肝素加入

4.0)

g/gm (3.5

dezili

bo3.0

mmi nir a2.5

peH

2.0

123456

Reaction time (d)

图6 反应时间对肝素密度的影响

Fig.6 The influence of reaction time on the ligand density

of heparin

量30 mg/g. 在此条件下，制得的肝素−琼脂糖凝胶介质上的肝素密度为4.3 mg/g，换算成以介质体积计算的肝素密度为2.7 mg/mL.

由于肝素分子的活性在很大程度上依赖于沿糖链的功能团的分配形式和数量，本研究的偶联方式仅是肝素分子还原末端醛基(⎯CHO)与胺基琼脂糖凝胶上的胺基(⎯NH2)共价偶联，确保了肝素分子上其他基团如羧基的完整性，可自由地与各种生物物质如凝血酶、抗凝血酶等相互作用，所以采用这种方法制备的肝素−琼脂糖凝胶亲和层析介质能与AT−III等生物活性分子之间有良好的亲和活性.

3.2 纯化分离人血浆中AT−III

自制介质和进口介质对AT−III的亲和层析谱图如图7所示. P1, P2和P3分别为穿透峰、淋洗峰和洗脱峰.从图可以看出，这两种介质的层析行为相似，淋洗峰和

洗脱峰具有对称性好、峰窄的特点.

图8是自制和进口介质洗脱峰的SDS−PAGE电泳

结果图. 与标准品比较可知，两种介质的洗脱峰样品中除AT−III外，均还有一种能与肝素结合的血浆蛋白存在，其分子量稍高于AT−III. 为此采用两种方法：一是将淋洗液Buffer 2中的NaCl浓度增加到0.7 mol/L，以使洗脱AT−III前从凝胶上去除更多的吸附杂蛋白；二是在血浆预处理时，在PEG沉淀前增加BaCl2沉淀步骤，以除去凝血酶原. 但得到的电泳结果仍显示是两条带.

据文献报道，由于富含组氨酸糖蛋白(Histidine-rich Glycoprotein, HRG)对肝素也有亲和性，可与肝素结合，其分子量为75000[14]. 所以可以根据HRG(pI=6.8)和AT−III(pI=5.1)带电性质的不同，采用DEAE−Sephadex离子交换层析将二者分离，也可以在血浆预处理过程中增加DEAE−Sephadex离子交换层析步骤. 今后还需要对分离工艺进一步优化.

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Adsorbance at 280 nm (AU)

[***********]500

20

40Time (min)

60

80

Adsorbance at 280 nm (AU)

400

[***********]100500

2040Time (min)

6080

图7 肝素−琼脂糖凝胶介质对AT−III的亲和层析图谱

Fig.7 Affinity chromatogram of antithrombin III from human plasma on heparin−agarose column

(Column: 56 mm×10 mm I.D., flow rate 1.0 mL/min, wavelength 280 nm)

1 2 3 4

97.4 kD 66.2 kD

43.0 kD 31.0 kD 20.1 kD 14.4 kD

1. Molecular weight marker

2. Fractions recovered from affinity chromatography on self-prepared heparin−agarose

3. Fractions recovered from affinity chromatography on Heparin−Sepharose CL-6B from Pharmacia 4. Pure AT-III

从人血浆组分中分离纯化AT−III的各步纯化结果见表1. 从表可以看出，采用自制介质，原料血浆10 mL，经过两步PEG沉淀和亲和层析后，得到0.8082 mg蛋白，比活为3.93 IU/mg，从血浆开始计算的活性回收率为31.76%. 在相同的操作条件下，进口介质的活性回收率为36.37%.

表2为自制介质与进口商品介质性能的比较，自制的肝素−琼脂糖凝胶6FF介质对AT−III的分离性能与Heparin−Sepharose CL−6B相似. 为实现琼脂糖凝胶介质的国产化，本实验采用的是自制的琼脂糖凝胶基质，配基密度的差异与琼脂糖凝胶基质的结构或配基的连接方法有关. 配基密度与分离效果的关系还有待进一步深入研究.

图8 自制介质和进口介质洗脱峰的SDS−PAGE电泳分析结果

Fig.8 SDS-PAGE analysis of fractions recovered from affinity

chromatogram column

表1 人血浆中AT−III各步纯化结果

Table 1 Distribution of protein and AT-III in the various fractions obtained from purification procedures

Operation step Total protein (mg) Human plasma (10 mL) 752.72 Supernatant of 15% PEG precipitation 467.13 Dissolved precipitate of 20% PEG precipitation 233.50 Elution fraction (Self-prepared media) 0.8082

Note: 1 IU was defined as AT-III activity in 1 mL normal pooled plasma.

Total activity (IU)

10 7.8585 4.2966 3.1756

Specific activity (IU/mg)

0.0133 0.0147 0.0184 3.9292

Purification fold

1 1.2648 1.3835 295.43

Recovery (%)

100 78.59 42.97 31.76

表2 自制介质与进口介质性能比较

Table 2 Performance comparison of two kinds of affinity media

Performance Heparin−Agarose 6FF (Self-prepared) Ligand density of heparin (mg/mL) 2.7 Chromatographic shape Similar Electrophoresis analysis Similar Recovery (%) 31.76

Heparin−Sepharose CL-6B (Pharmacia)

2 (Reported data)

Similar Similar 36.37

4 结 论

本实验以自制的琼脂糖凝胶为基质，将肝素以共价键形式偶联到琼脂糖凝胶上，得到了以肝素为配基的亲

和层析介质，偶联到琼脂糖凝胶上的肝素密度为2.7 mg/mL. 该介质对蛋白质的非特异性吸附能力低，对AT−III具有良好的亲和活性，从血浆开始计算的AT−III

第5期 穆成华等：肝素−琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用 549

活性回收率为31.76%. 与Pharmacia 公司的Heparin− Sepharose CL−6B比较，两种介质对AT−III的亲和能力、层析行为等方面相似. 自制介质成本低，有望为实现琼脂糖凝胶介质的国产化奠定基础，并推动相关生物产品的发展.

参考文献：

[1] Murano G, Williams L, Miller-Andersson M. Some Properties of

Antithrombin III and Its Concentration in Human Plasma [J]. Thromb. Res., 1980, 18: 259−262.

[2] 赵维莅，王鸿利. 抗凝血酶制剂的临床应用 [J]. 国外医学输血及

血液学分册, 1999, 22(2): 90−93.

[3] Miller-Andersson M, Borg H, Andersson L O. Purification of

Antithrombin III by Affinity Chromatography [J]. Thromb. Res., 1974, 5: 439−452.

[4] Smith J K, Winkelman L, Evans D R, et al. Pasteurized Antithrombin

III Concentrate for Clinical Use [J]. Vox Sang, 1985, 48: 325−332. [5] Thaler E, Schmer G. A Simple Isolation Procedure for Human and

Bovine AT-III/(Heparin Cofactor): A Comparison of Two Methods [J]. Br. J. Haematol., 1975, 31: 233−243.

[6] Lebing W R, Hammond D J, Wydick D J, et al. A Highly Purified

AT-III Concentrate Prepared from Human Plasma Fraction IV-1 by

Affinity Chromatography [J]. Vox Sang, 1994, 67: 117−124. [7] 姜世明，徐朝晖，张振宇. 肝素−琼脂糖凝胶4B的制备及在肝生

长因子提取纯化中的应用 [J]. 山东师范大学报(自然科学版), 1995, 10(4): 420−423.

[8] Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N. Activation of Sepharose with

Epichlorohydrin and Subsequent Immobilization of Ligand for Affinity Adsorbent [J]. J. Biochem., 1979, 85: 1091−1098.

[9] Varshavskaya M Y, Klibanov A L, Goldmacher V S, et al. A Simple

Method for the Determination of Heparin Content in Heparin Sepharose [J]. Anal. Biochem., 1979, 95: 449−451.

[10] 陈红兵，郑佐娅，李稻. 人凝血酶和抗凝血酶的联合提纯 [J]. 中

国实验诊断学, 2001, 5(5): 236−238.

[11] Laemmli U K. Cleavage of Structural Protein during the Assembly of

the Head of Bacteriophage T4 [J]. Nature, 1970, 227(259): 680−685. [12] Swain M, Ross N W. A Silver Stain Protocol for Proteins Yielding

High Resolution and Transparent Background in Sodium Dodecyl Sulfate−Polyacrylamide Gels [J]. Electrophoresis, 1995, 16(6): 948−951.

[13] 龚道元，李子萍，凌光鑫. 微量发色三肽底物法测定抗凝血酶III

活性及其临床应用 [J]. 江西医学检验, 2000, 18(4): 200−202. [14] Koide T, Odani S, Ono T. Human Histidine-rich Glycoprotein:

Simultaneous Purification with Antithrombin III and Characterization of Its Gross Structure [J]. J. Biochem., 1985, 98: 1191−1200.

Preparation of Heparin−Agarose Gel 6FF and Its Application in the Purification of Antithrombin III

MU Cheng-hua1,2, YAO Hong-juan1, MA Guang-hui1, LIAN Bin2

(1. State Key Lab. Biochem. Eng., Inst. Process Eng., Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China;

2. Inst. Chem. Biotechnol., Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550003, China)

Abstract: The self-prepared bead-formed agarose gel was used as the affinity support, and heparin was employed as the ligand. Heparin was linked covalently to amino-agarose beads, which was prepared by amination of epoxy-agarose beads. The effects of operating conditions on the coupling reaction were investigated and optimized. The amount of heparin immobilized on the synthesized gel was 2.7 mg/mL medium. The synthesized affinity medium was used to isolate antithrombin III from human plasma. The recovery of antithrombin III activity was 31.76%, which was similar to that of Heparin−Sepharose CL-6B from Pharmacia, Sweden. Key words: affinity chromatography; heparin; antithrombin III