基因工程详细流程TLTLTLTL

基因工程实验注意事项

1． 上实验课不能迟到。

2． 一定要提前预习实验内容，弄懂实验原理，理清实验顺序。根据实验内容和步骤制定一

个详细的试验计划（没有计划或计划不合理者不能进入实验操作）。

3． 实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操

作技术。各小组学生需要根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。

4． 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。 5． 本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等

严格的作息安排，一切服从实验进度，但必须在10天之内完成。

6． 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！ 7． 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中

发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

8． 写作实验报告一定要文字整洁，观察记录详细（包括操作的错误），分析现象透彻。 9． 在实验室内不能大声喧哗。

10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁

随地投弃！ 11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离

开实验实。

12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。 13．实验时损坏的任何物品都要按规定赔偿。

实验流程参考图

第一部分 质粒DNA 的提取和酶切电泳鉴定

实验一 质粒DNA 的小量制备

1．目的

学会最常用的小量制备质粒的DNA 的碱裂解方法。 2．原理

根据共价闭合环状质粒DNA 与线性DNA 在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5

这个狭窄的范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA 也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH 恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA 复性快速，而线性的染色体DNA 复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA 一起沉淀下去。 3．器材

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml 微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面离心管架，试管架，标签纸等，磁力搅拌机。 4．试剂

pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK 载体菌，LB 培养基1000ml （含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（solution I），NaOH/SDS溶液(solution II)，KAc 溶液（pH4.8）(solution III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。 5．实验准备

氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20︒C 保存），配制LB 培养基（胰化

蛋白胨10g ，酵母提取物5g ，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200μL 1mol/L NaOH调pH 至7.0，加dd water至1L ，121︒C 20min灭菌）；溶液I （50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II （0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III （60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml ），70%乙醇（-20︒C 保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA 酶溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml 离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121︒C 30min）。 6．操作步骤

（1） 在超净工作台中取5ml LB（Amp +），加入灭菌的摇菌管中。

（2） 从超低温冰箱中取出保存pET-his 载体的菌种和pMD-18T-NK 的菌种（操作完后

迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB 培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37︒C 摇床中摇20h 。

pET-his 菌： 接种于5ml LB（Amp +） pMD18-T 菌：接种于2ml LB（Amp +）

（3） 取1.5ml 的菌液于1.5ml 离心管中，15000rpm 离心1min ，弃上清液（尽量弃干

净），留沉淀备用。

pET-his 菌： 3管（3×1.5ml ） pMD18-T 菌：1管（1.5ml ）

（4） 在沉淀中加入100μl 溶液I ，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置

5min 。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）

（5） 加入200μl 溶液II ，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min 。 （6） 加入150μl 溶液III ，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min 。 （7） 15000rpm 离心5min ，小心吸取400μl 上清液于另一个干净的1.5ml 离心管中，

（不要将白色沉淀物带入！），加入800μl 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min 。

（8） 15000rpm 离心10 min，小心弃掉上清液，加入500μl 70% 乙醇，盖上盖后立即

在涡旋混合器上混匀。15000rpm 离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干

净

（9） 再加入500μl 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm 离心10

min ，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净

（10） 离心管倒置于37︒C 培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA 用肉

眼几乎看不见！）。

（11） pMD18-T 加入30μl 蒸馏水（高压过）或TE 缓冲液； 3管pET-his 质粒中每管

加入10μl 蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his 质粒中加入1μl RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。

（12） 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起

倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告

（13） 有条件的话，可以选作用分光光度计测定质粒DNA 的浓度：用dd water稀释20

倍，并以dd water 为对照，在波长260nm ，280nm 及310nm 处读OD 值。通过下列公式计算DNA 的浓度（μg/mL）：

ssDNA 浓度=33⨯（OD 260—OD 310）⨯稀释倍数 dsDNA 浓度=50⨯（OD 260—OD 310）⨯稀释倍数 ssRNA 浓度=40⨯（OD 260—OD 310）⨯稀释倍数

7．思考

（1） 影响本实验结果的因素有哪些？

实验二 质粒DNA 电泳鉴定

1．目的

学会常用的DNA 琼脂糖凝胶电泳、。 2．原理

DNA 双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA 由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。 3．器材

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml 三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml 离心管，双面离心管架，试管架等。 4．试剂

pET-his 质粒，pMD18-T-NK 载体，TAE 电泳缓冲液，1000⨯溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10⨯加样缓冲液（或6⨯加样缓冲液），DNA 分子量标准（λDNA HindIII: 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp）。 5．实验准备

配制TAE 电泳缓冲液（50⨯储存液，pH 约8.5：Tris 碱 242g ，57.1ml 冰乙酸，37.2g

Na 2EDTA.2H 2O ，dd water 定容至1L ），1000⨯溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg 溴化乙锭溶于100mL dd water，4︒C 避光储存），10⨯加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na 2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6⨯加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。 6．操作步骤

（1） 称取0.5g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1⨯) ，放入微波炉

中烧开（1min ）。50ml 正好到两块小胶。

（2） 注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出

到微波炉中！）。

（3） 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60︒C ）。 （4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。与模具的矮边缘相平即

可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再使用）。

（5） 在水平电泳槽中加满1⨯TAE 电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调

至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。

（6） 待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取

出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。

（7） 取1个1.5ml 离心管，各加入1μl 10⨯加样缓冲液。分别加入6μl 蒸馏水，再加入

3μl 质粒DNA 溶液制成10μl DNA样品。

（8） 在凝胶上选择四个相邻的加样孔。用10μl 的吸液头分别将管中的样品加入凝胶

的加样孔中，在相邻的加样孔中加入1.5-3μl DNA分子量标准物。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。

（9） 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，

立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min 。

（10） 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm 时，关闭电源。取出模具和凝胶。

（11） 把凝胶小心反扣放入塑料盒子中，在胶上估计有DNA 的位置上滴两滴EB ，轻

轻转动凝胶，使EB 均匀分布在胶上。放置3分钟后，加入自来水淹没凝胶，在脱色摇床上轻轻摇动5min ，弃掉水溶液，再加入自来水摇洗10min 。放入凝胶成像系统中拍照。

（12） 清理垃圾。染有EB 的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。 （13） 撰写实验报告。 7．思考

（1） 泳道中的质粒DNA 有几条带？为什么？ （2） 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp 的DNA? （3） 影响本实验结果的因素有哪些？

实验三 质粒DNA 的酶切

1．目的

学会用限制性内切酶切割质粒DNA 。 2．原理

II 型限制性内切酶能识别双链DNA 内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成

粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA 混合物能够确认和分离酶切片段。 3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，水漂，恒温水浴。 4．试剂

pET-his 质粒，EcoR I，BamH I，限制性内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液 5．实验准备

配制TAE 电泳缓冲液（50⨯储存液），1000⨯溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10⨯加样缓冲液，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）

6．操作步骤

（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml 微量离心管中：

pET-his DNA (或pUCm-T-NK ) 6 μL 10×酶切缓冲液（用EcoRI 的缓冲液） 4 μL dd water 28 μL EcoRI 1μL BamHI 1μL 总体积 40μL

（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰

块中。

（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手

持微量移液器，小心翼翼地吸取1-2 μL限制性内切酶。

（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动

微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm 离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3 h（一般是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA （如先前的PCR 产物）对比电泳，

以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

（6）酶切后的质粒可以回收备用（见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA 片断）。 （7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。 7．思考

（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？ （2）酶切的温度对酶切效果有何影响？

（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能别免浪费？

第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建

实验四 PCR 扩增制备目的基因

1．目的

学会PCR 操作的基本技术。 2．原理

是将待扩增的DNA 模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐

热的DNA 聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n 次循环后DNA 可被扩增（1+X）n 倍。其中

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面离心管架，PCR 仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。 4．试剂

3U/μl Taq DNA聚合酶（华美），PCR 缓冲液（10×，MgCl 2 free），25mM MgCl2，dNTP ，引物，模板质粒pMD18-T-NK ，无菌dd water。 5．实验准备

dNTP 混合液（每种25mM ），TAE 电泳缓冲液，1000⨯溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），

10⨯加样缓冲液，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）

合成引物：Sense primer TGGC-3'

Antisense primer

目的基因模板：克隆于pMD18-T 载体上的1181bp 纳豆激酶（nattokinase ，NK ）基因。 待扩增的NK 片段：837bp （825bp NK+5’BamH I位点GGATCC ，3’EcoRI位点GAA TTC ）。 6．操作步骤

（1）在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终

需要量，实验时需参照Taq 酶说明书计算） dd water 32μl 10×PCR buffer（不含MgCl 2） 5μl 25mM MgCl2 3μl

2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP 终浓度0.2mM ） 10μmol/L Primer1 2μl（12.5—25pmoles ） 10μmol/L primer2 2μl （12.5—25pmoles ） 模板质粒 1μl （1×10-3pmoles ） 3U/μl Taq酶 1μl （3u ） 总体积 50μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR 仪的循环程序： ① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 60℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto ② 29 times ⑥ 72℃ 10min

（3）PCR 结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。 （4）清理桌面，撰写实验报告。

（5）PCR 产物可以直接与T 载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。 7．思考

（1）复性温度如何确定？

（2）为什么要在最后延伸10min ？

（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？

实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片断

1．目的

学会从琼脂糖凝胶中回收DNA 片断的基本技术。 2．原理

限制性内切酶切割后的DNA 片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝

胶中，可以将特定的某条DNA 带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA 溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得想要得酶切片断。 3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。 4．试剂

电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，电泳级琼脂糖粉，10⨯加样缓冲液，DNA 分子量标准，DNA 凝胶回收试剂盒（RESINcolumn TM 琼脂糖DNA 纯化系统）。 5．实验准备

配制TAE 电泳缓冲液（10⨯储存液），1000⨯溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10⨯加样缓冲液，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）； 6．操作步骤

（1）用1⨯TAE 配制1%琼脂糖凝胶。DNA 用合适的酶切。

（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA 酶切产物，电泳。 （3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA 酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），

EB 染色，在紫外灯下找到目的DNA 带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。含有大量DNA 酶切产物的凝胶既不用EB 染色，也不用紫外灯照射。

（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大

胶上DNA 酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA 产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个干净的1.5ml 微量离心管中。

（5）按照DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA 酶切产物：

（6）向切割的胶块中加入等体积的熔胶剂，65℃水浴5-15min 直到胶完全融化。

（7）充分混匀琼脂糖-DNA 纯化树脂，抽出0.6ml 树脂悬浮液加入到0.2-0.6ml 溶胶液中，

颠倒4-5次混匀。

（8）抽出注射器活塞，将注射器筒插入微量离心柱，并拧紧。然后将树脂-DNA 混合物加

入注射筒，静置1min 。

（9）将注射器活塞插入注射器，缓慢用力向下压，排出所有的液体和空气。

（10）从微量离心柱上拔掉整个注射器，抽出活塞，将注射器筒插入微量离心柱，并拧紧。 （11）将2ml I-型柱子清洗液加入注射器。将注射器活塞插入注射器，缓慢用力向下压，排

出所有的液体和空气。

（12）取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml 无盖离心管，并拧紧。 （13）向离心柱中加入150ul I-型柱子清洗液，1500 0rpm室温离心1min 。

（14）将微量离心柱插入一个新的1.5ml 离心管，并拧紧，向离心柱中加入30-50ul TE 或

dd water，静置1min ，12000 rpm室温离心20s ，洗脱DNA 。 （15）可取2μl-5μl回收产物电泳，检测是否有目的DNA 带。 （16）清理桌面，撰写实验报告。 7．思考

（1）为何避免用EB 染色和用紫外灯照射目的DNA ？

实验六 目的基因片段与载体连接

1．目的

学会DNA 片断的体外连接技术。 2．原理

在Mg 2+和ATP 存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA 的相同

粘性末端联接成重组DNA 分子。 3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 4．试剂

pUCm-T 载体，pET-his 酶切载体，NK 插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 5．实验准备

1.5ml 离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基（含Amp ）。

6．操作步骤

1）PCR 产物与pUCm-T 载体直接连接：

（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16︒C 。 （2） 取一个灭菌的1.5ml 微量离心管，加入：

4μl PCR 产物混合液 1μl pUCm-T 载体

0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1μl 连接酶缓冲液 3.5 μl dd Water

总量 10μl 体系

（3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14︒C 干式恒温仪（或14︒C 水中）中

保温过夜。

（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4︒C 冰箱备用。 2）DNA 回收片断（NK ）与载体（pET-his ）连接： （1） 取一个灭菌的1.5ml 微量离心管，加入

4μl 回收DNA 片断 1μl 酶切后回收的载体

0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1μl 连接酶缓冲液 3.5 μl dd Water

总量 10μl 体系

（2） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14︒C 干式恒温仪（或14︒C 水中）

中保温过夜。

（3） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4︒C 冰箱备用。 7．思考

（1）连接酶的最适温度室多少？ （2）为什么要采用14︒C 下连接？

第三部分 感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定

实验七 感受态菌的制备

1．目的

学会CaCl 2法制备大肠杆菌感受态细胞。 2．原理

细菌在0︒C CaCl 2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA 的

状态。 3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。 4．试剂

E. coli DH5α，E. coli BL21，LB 培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water 5．实验准备

1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB 培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌dd Water，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。 6．操作步骤

（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。 （2）从超低温冰柜中取出DH5α菌种和by121菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红

的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。 （3）取0.5ml 上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培

养2~3h ，测定OD 590为0.375（

（4）将菌液分装到1.5mL 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min ，然后于4℃，

5000rpm 离心10min 。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合

器上混匀，插入冰中放置30min 。

（6）4℃，5000rpm 离心10min ，弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl 2溶液垂悬，

插入冰中放置30min 。

（7）4℃，5000rpm 离心10min ，弃上清液后，用200μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，

超净工作台中按每管100μL 分装到1.5mL 离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 7．思考

（1）制作感受太菌的过程中，应注意那些关键步骤？ （2）CaCl 2溶液的作用是什么？

附LB 培养基配置LB 培养基的配方如下: 蛋白胨(Tryptone) 10g/L

酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L

按比例溶解在蒸馏水中，装入锥形瓶中，用纱布+报纸或牛皮纸封口，高压蒸汽灭菌20分钟。可以调PH 到7.0，一般都不用调，本身就在7.0左右。

实验八 细菌转化

1．目的

学会质粒DNA 转化感受态受体菌的技术。 2．原理

质粒DNA 粘附在细菌细胞表面，经过42︒C 短时间的热击处理，促进吸收DNA 。然后

在非选择培养基中培养一代，质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp ），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 4．试剂

LB 培养基（不加抗菌素），LB 培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG ，X-gal 。 5．实验准备 无菌dd water，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。 6．操作步骤

（1） 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2） 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰

上，冰浴5~10min 。

（3） 加入5μL连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过100ng ），轻轻震荡后放置冰上

20min 。

（4） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min 。 （5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，

然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h 。

（6） 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB

平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 2% X-gal，7μL 20% IPTG ，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min 直到表面的液

体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（8） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（9） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

7．思考

（1）影响转化效率的因素有哪些？

（2）对照实验的平板上是否也长出了菌落？如果长出菌落，请讨论其原因。 （3）白色菌落出现的原理是什么？

温育的时候，培养基的水分要蒸发，形成水珠，如果正放的话水珠集聚在培养基平面上会影响菌落的生长，所以要保证培养基的干燥，就得倒置培养. 这是一点, 还有就是便于拿取, 大下小上, 不会打掉. 也防止外物掉在培养基上.

氨苄青霉素属于β-内酰胺类抗生素，其β-内酰胺环极易破坏而失效，何况高压灭菌了（高温加高压），可以说导致完全失效。所以氨苄青霉素不可以进行高压灭菌的！！！一般制备氨苄青霉素是采用无菌操作法、冷冻干燥技术（真空条件下使冰直接升华，得以除去水分）制备的。氨苄青霉素d 的失活温度是40摄氏度

IPTG ：8ml 蒸馏水中溶解2g IPTG后定溶至10ml ，0.22um 滤器过滤除菌，分装，-20 oC保存。

【X-gal 溶液配制方法】X-gal 为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal 配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal 溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal 溶液无须过滤除菌。

实验九 转化克隆的筛选和鉴定

1．目的

学会用PCR 法和酶切法鉴定重组质粒转化成功的克隆菌。

2．原理

利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落

中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。

3．器材

旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。

4．试剂

LB 培养基（加抗菌素），PCR 用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。

5．实验准备

无菌dd water，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭

菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/mL氨苄青霉素。

6．操作步骤

方法一：快速PCR 筛选法

（1） 在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的

培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

dd water 16μl

10×PCR buffer（不含MgCl 2） 2.5μl

25mM MgCl2 1.5μl

2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP 终浓度0.2mM ）

10μmol/L Primer1 1μl（12.5—25pmoles ）

10μmol/L primer2 1μl （12.5—25pmoles ）

模板质粒 用小tip 头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR 混合液中洗一洗 Taq 酶 0.5μl （1.5u ）

总体积 25μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR 仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ ）：

① 94℃ 5min

② 94℃ 1min

③ 60℃ 1min

④ 72℃ 1min50s

⑤ goto ② 29 times

⑥ 72℃ 10min

（2） PCR 结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。观察

胶上是否有预计的主要产物带。

（3） 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒

（4） 提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。 方法二：提质粒再PCR 或酶切鉴定

（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50μg/mL氨苄青霉素），用记

号笔写好编号。

（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙

签的尖部接触转化的平板培养基 上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50μg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。

（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

（4）提取到的3管质粒样品可用PCR 法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插

入片断（方法见有关实验）。

（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大

培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500μL 菌液与500μL 65%甘油混合后-80℃保存。

（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

7．思考

画出设计用酶切法或PCR 法鉴定插入片断的方案和预计的电泳结果。并与实验结果进

行对比讨论。

第四部分 目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE 鉴定

实验十 外源基因的诱导表达

1．目的

了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

2．原理

外源基因克隆在含有lac 启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白

与lac 操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE 或Western-blotting 检测。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。

4．试剂

LB 培养基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖

5．实验准备

无菌dd water ，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭

菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml IPTG （过滤灭菌）（100μl 分装，-20︒C 保存），100mg/mL氨苄青霉素（过滤灭菌）（100μl 分装，-20︒C 保存）。配制20%葡萄糖（8磅灭菌20分钟，添加至上述LB 中，终浓度为0.2%）。

6．操作步骤

（1） 晚上9：00接种。在超净工作台中接种含有pET-his NK重组载体的菌株，培养于

两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的摇菌管中，慢速70--90转/分钟30︒C 摇菌过夜。

（2） 至第二天上午8：30 OD600约为0.5，加IPTG 至 100μg/ml，150--170转/分钟

37︒C 诱导1.5-3h 。同时做一个不加IPTG 的对照培养。

（3） 4000rpm 离心15min 弃掉上清液，收获菌体，走SDS —PAGE 电泳分析。菌体也

可放在-20︒C 以下保存备用。

（4） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

注：有兴趣的同学可以向教师索取一个温度诱导型的高表达科研菌株，进行诱导表达实验，以便于在SDS-PAGE 胶上更清晰地观察外源基因的大量表达。操作如下：

（1） 在超净工作台中接种工程菌株至1.5ml LB 培养基（含抗菌素Amp ）中，28︒C 摇

过夜。

（2） 取300ul 菌液加入3ml LB培养基（含抗菌素Amp ）中，28︒C 摇2-3h 。

（3） 将温度调至42︒C 摇4-5h ，诱导表达。

（4） 10000rpm 离心1min 弃掉上清液，收获菌体，加水至50μl 。

（5） 菌体重悬后与等量 2×蛋白加样缓冲液混合，混匀，煮沸5min ，走SDS —PAGE

电泳分析（表达蛋白分子量为42.5kDa ）。

7．思考

（1）IPTG 的作用原理是什么？

（2）为什么要增加抗菌素的用量？

实验十一 SDS-PAGE 检测表达蛋白

1．目的

学习SDS-PAGE 的基本操作，学会用SDS-PAGE 检测蛋白。

2．原理

蛋白质在加热变性以后与SDS 结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结

果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，饭盒。

4．试剂

SDS （十二烷基磺酸钠），Acr （丙烯酰胺），Bis （N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris （三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps （过硫酸氨），TEMED （四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa ），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，

β-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。

5．实验准备

1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4︒C 保存）；0.5mol/L Tris HCl，pH6.8（4︒C 保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL ，4︒C 保存）；10%Aps （-20︒C 保存）；2⨯上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油2mL ，20%SDS 2mL，0.1%溴酚蓝 0.5mL ，β-2-巯基乙醇 1.0mL ，dd water 2.5mL，室温存放）；5⨯电泳缓冲液（Tris

7.5g ，甘氨酸36g ，SDS 2.5g，加dd water至500mL ，使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL ）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）；

6．操作步骤

（1） 将表达后的菌体与2⨯上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。

（2） 用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定

要将超声波探头插入容液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！

（3） 将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min 。然后立即

插入冰中。（可在-20︒C 冰柜中保存）。

（4） 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（观察教师的演

示）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm 的地方做一个标记。

（5） 配制10%分离胶。按顺序和量取下列溶液混在一个50mL 的小烧杯中（注意Tris

为 pH8.8）：

Acrylamide-bis 3.96 mL

1M Tris PH8.8 4.38 mL

d.d Water 3.432 mL

10% SDS 118.8 μL

TEMED 9.9 μL

10%APS 118.8 μL

（6） 加完APS 后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝

中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后

在上部用1000μl 微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满dd water（尽可能

不破坏下面的胶液）。然后静置30min 。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏

水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。

（7） 配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50mL 的小烧杯

中（注意Tris 为 pH6.8）：

Acrylamide-bis 0.675 mL

0.5M Tris pH6.8 0.563 mL

dd water 3.165 mL

10% SDS 45 μL

TEMED 7.5 μL

10% APS 45 μL

（8） 加完APS 后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，

液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min 。烧杯中剩下的

溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。

（9） 小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的

水，并修平加样槽底部的胶面。

（10） 选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面

的一个加样槽中加入20μL 蛋白分子量，其它槽中加入10～20μL 自己制作的样

品。

（11） 加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳

槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml, 淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入

一半电泳缓冲液（约180ml ）。

（12） 接好电极，将电流调至10mA ，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA ，

电泳约2 3h ，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，

电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm 时切断电源。

（13） 在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。

（14） 倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬

起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒

染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。

（15） 染色2h 后，在将染液倒回瓶子里以备重复使用。在饭盒里倒入脱色液，过夜。

（16） 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子

量（NK 蛋白约30kDa ），判断是否是预期的基因产物。

（17） 清理桌面，写实验报告。

7．思考

（1）影响表达的因素都有哪些？

（2）如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？

附录1：表达载体pET-His 的相关资料：

长度: 2.9kb

thrombin cut site

— CTG GTG CCG CGC Leu Val Pro Arg BamHI EcoRI

NheI HindIII

XbaI

atccgcagaattcagcgctagctaacatcatcatcatcat HindIII

载体其它部分序列见pUC18 (不含pUC18多克隆位点)

产物的N 端具备6个His ，便于采用chelating sepharose 亲和层析纯化目标蛋白。

附录2：从NIH 查阅的nattokinase （纳豆激酶）序列之一：

/translation="AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVA VIDSGIDSSHPDLNV

RGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHV AGTIAALNNSIGVLGV APSASL YAVKVLDSTGSG

QYSWIINGIEWAISNNMGVINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSG

SSSTVGYPAKYPSTIA VGA VNSSNQRASFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYN

GTSMA TPHV AGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAQ"

ORIGIN

primer

61 tacacaggct ctaacgtaaa agtagctgtt atcgacagcg gaattgactc ttctcatcct 181 ggcagttctc acggtacgca tgtagccggt acgattgccg ctcttaataa ctcaatcggt 241 gttctgggcg tagcgccaag cgcatcatta tatgcagtaa aagtgcttga ttcaacagga 301 agcggccaat atagctggat tattaacggc attgaatggg ccatttccaa caatatgggt 361 gttattaaca tgagcctcgg cggaccttct ggttctacag cgctgaaaac agtcgttgat 421 aaagccgttt ccagcggtat cgtcgttgct gccgctgcag gaaacgaagg ttcgtccgga 481 agctcaagca cagtcggcta ccctgcaaaa tatccttcta ctattgcggt aggtgcggta 541 aacagcagca accaaagagc ttcattctca agcgcaggtt ctgagcttga tgtgatggct 601 cctggcgtat ccatccaaag cacacttcct ggaggcactt acggtgctta caacggcacg 661 tccatggcga ctcctcacgt tgccggagca gcagcgctaa ttctttctaa gcatccgact 721 tggactaacg cacaagtccg tgatcgttta gaaagcactg caacatatct tggaaactct primer

PCR 扩增NK 片断的长度和常用限制性内切酶图谱如下：

BamHI —————HindIII ——————————————————EcoRI 1-6bp 150-156bp 832-837bp

附：

常用的DNA 分子量标准（bp ） 蛋白质分子量标准（kDa ）

DNA HindIII:：

97.4 23130 66.2 9461 6557 43 4361 31 2322 2027 20.1 564 14.4

附录3：本实验所用的克隆载体图